基于UPLC 指紋圖譜及多指標(biāo)定量分析的訶子藥材質(zhì)量研究*

王 巍，張 強(qiáng)，陳九妹，鞠成國

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

訶子原產(chǎn)于印度、緬甸等地，原名“訶黎勒”，在唐代隨佛教傳入我國，目前，收載于《中國藥典》2020版一部，為使君子科植物訶子Terminalia chebula Retz.及絨毛訶子Terminalia chebula Retz. var. tomentella Kurt. 的干燥成熟果實(shí)[1]，具有澀腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽之功效，多用于治療“腸澼”。本課題組在研究過程中收集到的藥材多為訶子，極少見絨毛訶子。其中部分云南和新疆所產(chǎn)訶子藥材與廣西、廣東所產(chǎn)訶子藥材在外觀上存在較大差別。藥典中對(duì)訶子的質(zhì)量控制方法還僅限于顯微鑒別和以對(duì)照藥材為參照的薄層色譜鑒別，欠缺對(duì)主要成分的定性及定量分析。鑒于此情況，本研究在建立訶子高效液相指紋圖譜的基礎(chǔ)上，對(duì)共有峰進(jìn)行主成分分析，并對(duì)可識(shí)別的主要成分進(jìn)行含量測定，為訶子藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)，并為對(duì)其進(jìn)行深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與藥材

1260 Infinity II 型超高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；FA1004B 電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

沒食子酸、鞣花酸購自成都曼思特生物科技有限公司（純度≥98%，批號(hào)分別為MUST-13040103、MUST-14031010），柯里拉京、訶黎勒酸、五沒食子酰基葡萄糖、訶子酸購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司（純度≥98%，批號(hào)分別為PRF9101742、PRF8112 302、PRF9091704、PRF8071201）；沒食子酸乙酯為本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)HPLC 鑒定純度≥98%；甲醇、H3PO4為色譜純；水為超純水。17 批訶子藥材經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)張慧教授鑒定均為訶子Terminalia chebula Retz.的干燥成熟果實(shí)。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液制備 精密稱取各批次訶子粉末（去核，粉碎，過60 目篩）0.1g，加入70%甲醇溶液50mL，精密稱定重量，超聲提取20min，放冷，再以70%甲醇溶液補(bǔ)足損失重量，搖勻，經(jīng)0.22μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得[2]。

1.2.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取沒食子酸、沒食子酸乙酯、柯里拉京、訶黎勒酸、鞣花酸、五沒食子酰基葡萄糖、訶子酸對(duì)照品適量，置于10mL 容量瓶，加入甲醇定容，分別制成濃度為0.22250、0.17400、0.68875、0.25250、0.17750、0.31625、0.49125mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

1.2.3 色譜條件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱（100mm×3.0mm，2.7μm）；流動(dòng)相0.3%磷酸水（A）：甲醇（B），梯度洗脫，程序如下：0～3min，B 為3%；3～5min，B 為3%～5%；5～15min，B 為5%～8%；15～25min，B 為8%～14%；25～30min，B 為14%～18%；30～35min，B 為18%～20%；35～38min，B 為20%～25%；38 ～45min，B 為25%；45 ～55min，B 為25% ～30%；55 ～60min，B 為30% ～45%；60 ～65min，B 為45% ～60%；65 ～70min，B 為60% ～100%；70 ～78min，B 為100%；78～80min，B 為100%～3%；。進(jìn)樣量2μL，流速0.8mL·min-1，柱溫30℃，檢測波長270nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.1.1 精密度試驗(yàn) 取S1批次樣品，按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.2.3”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，以訶黎勒酸計(jì)算各對(duì)照品相對(duì)保留時(shí)間RSD分別為0.82%、0.80%、0.67%、0.00%、0.95%、0.66%、0.78%，相對(duì)峰面積RSD 分別為1.30%、1.12%、1.35%、0.00%、1.19%、1.36%、1.22%，表明儀器精密度良好。

2.1.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1批次樣品，按“1.2.1”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“1.2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，以訶黎勒酸計(jì)算各對(duì)照品相對(duì)保留時(shí)間RSD分別為0.69%、0.68%、0.71%、0.79%、0.69%、0.68%、0.68%，相對(duì)峰面積RSD 分別為1.80%、1.92%、1.67%、1.77%、1.68%、1.82%、1.71%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1批次樣品，按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.2.3”項(xiàng)條件下，分別于制備后0、2、4、8、12、18、24、36、48h 進(jìn)樣，以訶黎勒酸計(jì)算各對(duì)照品相對(duì)保留時(shí)間RSD 分別為0.91%、0.87%、0.96%、0.00%、0.79%、0.90%、0.89%，相對(duì)峰面積RSD 分別為1.91%、1.87%、1.97%、0.00%、1.82%、1.80%、1.88%，表明供試品溶液在48h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 指紋圖譜建立

取各批次訶子（共17 批），按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，將所得色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012 版”，去除溶劑峰，剪切65min 之前的色譜峰，進(jìn)行共有峰的匹配，中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，以對(duì)照?qǐng)D譜計(jì)算各批次的相似度[3]。結(jié)果共識(shí)別26 個(gè)共有峰，與對(duì)照品對(duì)比鑒定，其中2 號(hào)為沒食子酸，11 號(hào)為沒食子酸乙酯，12 號(hào)為柯里拉京，19 號(hào)為訶黎勒酸，21 號(hào)為鞣花酸，22 號(hào)為五沒食子酰基葡萄糖，23 號(hào)為訶子酸。各批次相似度在0.626～0.971 之間，其中S8為0.626、S5為0.895、S10為0.841、S16為0.856，其余均在0.9 以上。各批次訶子指紋圖譜疊圖見圖1。

圖1 各批樣品UPLC 指紋圖譜Fig.1 UPLC fingerprints of different batche samples

2.3 主成分分析

將17 批樣品共有峰的峰面積作為原始數(shù)據(jù)，以SPSS 17.0 軟件進(jìn)行主成分分析，將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后計(jì)算相關(guān)矩陣的特征值及方差貢獻(xiàn)率，結(jié)果見表1。

表1 UPLC 指紋圖譜的主成分信息和方差貢獻(xiàn)率Tab.1 Principal component information and variance contribution rate of UPLC fingerprint

由表1 可見，以特征值（VIP）＞1 為提取標(biāo)準(zhǔn)[4]，得到前7 個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為91.182%（＞80%），說明前7 個(gè)主成分反映了訶子26 個(gè)成分中91.182%的信息量，基本上可以代表訶子UPLC指紋圖譜的特征。

對(duì)各主成分的權(quán)重比例與各共有峰對(duì)應(yīng)的相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 主要因子載荷矩陣表Tab.2 Main factor load matrix table

由表2 可見，7 種已知成分和其他未知成分均作為主要信息參與了訶子的質(zhì)量表達(dá)，其中第1 主成分主要反映了色譜峰6、8、9、10、16、17、19 （訶黎勒酸）、20、22（五沒食子酰基葡萄糖）的信息，第2 主成分主要反映了色譜峰2（沒食子酸）、11（沒食子酸乙酯）、12（柯里拉京）、15、23（訶子酸）、24 的信息，第3 主成分主要反映了色譜峰26 的信息，第4 主成分主要反映了色譜峰3 的信息，第5 主成分主要反映了色譜峰25 的信息，第6 主成分主要反映了色譜峰14 的信息，第7 主成分主要反映了色譜峰21（鞣花酸）的信息。

2.4 含量測定方法學(xué)考察

本研究建立的指紋圖譜分析方法，可同時(shí)對(duì)訶子中沒食子酸、沒食子酸乙酯、柯里拉京、訶黎勒酸、鞣花酸、五沒食子酰基葡萄糖、訶子酸7 種主要成分進(jìn)行含量測定。方法的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)參見“1.2.1”項(xiàng)下部分。

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 取S1批次樣品，按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取沒食子酸、沒食子酸乙酯、柯里拉京、訶黎勒酸、鞣花酸、五沒食子酰基葡萄糖、訶子酸苷對(duì)照品，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液，并制備混合對(duì)照品溶液，分別在“1.2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣。對(duì)照品溶液與供試品溶液色譜圖中各對(duì)照品色譜峰與相鄰峰分離良好。結(jié)果見圖2。

圖2 各成分UPLC 色譜圖Fig.2 UPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密稱取沒食子酸、沒食子酸乙酯、柯里拉京、訶黎勒酸、鞣花酸、五沒食子酰基葡萄糖、訶子酸對(duì)照品，以甲醇溶解并逐級(jí)稀釋。分別在“1.2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，回歸方程分別為：沒食子酸y=8672.1x+4.0441（r=0.9999）；沒食子酸乙酯y=5746.9x+0.9143（r=0.9999）；柯里拉京y=4699.9x-11.578（r=0.9999）；訶黎勒酸y=3790.5x-1.0095 （r=0.9998）； 鞣花酸y =6414.9x -1.445（r =0.9999）；五沒食子酰基葡萄糖y=5999x+0.8232（r=0.9999）；訶子酸y=3979.1x-2.6536（r=0.9999）。結(jié)果表明：沒食子酸在4.45～222.5μg·mL-1，沒食子酸乙酯在3.48～174μg·mL-1，柯里拉京在13.78～688.75μg·mL-1，訶黎勒酸在5.05～252.5μg·mL-1，鞣花酸在3.55～177.5μg·mL-1，五沒食子酰基葡萄糖在6.33 ～316.25μg·mL-1，訶子酸在9.83～491.25μg·mL-1與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.4.3 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取6 份已知含量S1批次樣品0.1g，加入相當(dāng)于樣品中成分含量100%的7 種對(duì)照品，按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率及RSD，結(jié)果表明，沒食子酸加樣回收率為98.96%，RSD為1.60%；沒食子酸乙酯加樣回收率為99.00%，RSD為1.68%；柯里拉京加樣回收率為99.03%，RSD 為0.95%；訶黎勒酸加樣回收率為99.79%，RSD 為1.05%；鞣花酸加樣回收率為98.41%，RSD 為1.19%；五沒食子酰基葡萄糖加樣回收率為100.39%，RSD 為1.22%；訶子酸加樣回收率為100.22%，RSD 為0.94%，均符合要求。

2.5 樣品含量測定

取17 批樣品，按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析，根據(jù)外標(biāo)一點(diǎn)法分別計(jì)算各成分含量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測定結(jié)果Tab.3 Results of content determination of various constituents

2.6 討論

訶子在我國藏醫(yī)、蒙醫(yī)中應(yīng)用極其廣泛，地位相當(dāng)于中醫(yī)中的甘草。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，藏醫(yī)、蒙醫(yī)中超半數(shù)以上的復(fù)方含有訶子[4]。現(xiàn)代化學(xué)研究表明，鞣質(zhì)是訶子的主要化學(xué)成分[5-7]，其中沒食子酸、沒食子酸乙酯、柯里拉京、訶黎勒酸、鞣花酸和訶子酸是含量較高的幾種鞣質(zhì)，而五沒食子酰基葡萄糖為一分子葡萄糖的1、2、3、4、6 位連接五分子沒食子酸，這7 種化合物是訶子中的代表性化合物，也是訶子的潛在質(zhì)量標(biāo)志物。然而現(xiàn)行中國藥典中并未對(duì)訶子中主要成分含量有所規(guī)定，在很大程度上限制了訶子質(zhì)量評(píng)價(jià)系統(tǒng)的完善。本實(shí)驗(yàn)的指紋圖譜相似度結(jié)果表明，各批次訶子相似度差別較大，質(zhì)量不一，其中S8質(zhì)量較差，相似度最低，從圖譜中可以明顯看出與其它批次具有顯著差異。主成分分析結(jié)果顯示，7 個(gè)指標(biāo)成分均作為主要信息因子參與了訶子的質(zhì)量表達(dá)，表明7 個(gè)指標(biāo)成分的含量與藥材質(zhì)量高度相關(guān)，可直接影響藥材質(zhì)量。7 個(gè)指標(biāo)成分的含量測定結(jié)果表明，各個(gè)批次成分含量差別較大，說明訶子各批次存在差異，驗(yàn)證了相似度的結(jié)果。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)方法以指紋圖譜相似度、主成分分析以及含量測定結(jié)果綜合評(píng)價(jià)訶子藥材質(zhì)量，結(jié)果準(zhǔn)確，可為訶子臨床用藥的安全有效提供依據(jù)及保障。本實(shí)驗(yàn)識(shí)別的7 種指標(biāo)成分可反映訶子藥材質(zhì)量，可能為訶子的潛在質(zhì)量標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)在藥材收集時(shí)并未收集到絨毛訶子，后續(xù)對(duì)于訶子藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)還需更全面的深入研究。