高效液相直接進樣法測定葡萄酒中的莧菜紅和胭脂紅

◎ 王麗君

（常州市武進區疾病預防控制中心，江蘇 常州 213164）

葡萄酒具有良好的保健作用，深受廣大消費者喜愛。普通葡萄酒不含人工色素，紅葡萄酒的顔色主要來源于葡萄皮中的一種“花青苷”。為增加葡萄酒的色澤，部分商家會添加一些色素來達到效果，尤其是一些市售葡萄酒中常添加胭脂紅、莧菜紅等合成色素，這些合成色素具有一定的毒性（包括毒性、致瀉性和致癌性），其毒性來自合成色素中的砷、鉛、銅、苯酚、苯胺、乙醚、氯化物和硫酸鹽，對人體均可造成不同程度的危害[1]。目前對合成色素的檢測方法有薄層色譜法、示波極譜法、多波長分光光度法和高效液相色譜法等[2-8]。本文在參考國家標準的基礎上對高效液相法進行改進，以提高實驗準確度。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜儀（日本島津LC-10ATvp、SPD10Avp紫外檢測器）；色譜柱（CTO-10Asvp），填充物（C18）；超聲波振蕩器。

甲醇（優級純），0.02 mol·L-1的乙酸銨（分析純）。色素標準品：胭脂紅GBW（E）100004a（批號：14001）；莧菜紅GBW（E）100002a（批號：14001）；除另有說明外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規定的一級水。

1.2 方法

1.2.1 標準系列的配置

標準品濃度為0.5 mg·mL-1，加純水將其稀釋至5.0 ng·μL-1作為使用液，用10 μL微量進樣針分別于樣品中加入標準量為0 ng、12.5 ng、37.5 ng、50.0 ng和75.0 ng，測定，作標準曲線，Y軸截距即為樣品中被測物質含量。

1.2.2 樣品前處理

樣品經0.45 μm濾膜過濾后直接進25 μL樣液測定。

1.2.3 色譜條件

色譜柱（CTO-10Asvp），填充物（C18）；柱溫40 ℃；流動相為 1.0 mL·min-1，A 為甲醇，B 為0.02 mol·L-1乙酸溶液；進樣量為25 μL；檢測過程中波長變換見表1，梯度洗脫設置見表2。

表1 波長程序表

表2 梯度洗脫程序表

2 結果與分析

2.1 波長的選定

根據各色素最大吸收波長和元素出峰時間設置時間波長程序可顯著提高被測物的靈敏度，《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》（GB/T 5009.35—2016）中要求二極管陣列檢測器的波長范圍為400～800 nm，紫外檢測器檢測波長為254 nm。本實驗測定時，經紫外檢測器掃描，確定莧菜紅在0～4 min測定時波長為520 nm，胭脂紅在4～11 min測定時波長為510 nm，在此檢測條件下，可提高待測物靈敏度，顯著減少樣品中干擾物質的出峰，且出峰峰形更好。在此條件下，加標樣品的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相葡萄酒加標色譜圖

2.2 方法線性范圍、回收率、精密度、檢測限

在2.1實驗條件下，得莧菜紅的線性回歸方程為y=2 057.7x+1 348.8，R2=0.999 0，胭脂紅的線性回歸方程為y=2 004.7x-69.21，R2=0.999 2。線性關系良好，相關系數在0.999以上，方法的加標回收率分別為95%和102%，相對標準偏差（RSD）為5.86%和6.84%，檢測限分別為 0.024 mg·L-1和 0.087 mg·L-1。

3 討論

3.1 波長程序的設定

每次開機測量時，各組分的保留時間會發生變化，因此，每次實驗前根據各組分的保留時間選擇合適的混合標準溶液以校正波長程序。在本實驗中，以國家標準為參考，根據樣品的自身特點選擇合適的波長和波長程序。當樣品分析的組分較多，基體較為復雜時波長程序的設定更為必要。

3.2 雙峰定量優化

直接進樣法測定時樣品基體復雜，色素在酒中可能會有部分轉化為其他物質。實驗中發現，加標法中莧菜紅的標準曲線用雙峰（即圖1中的峰1和峰2的峰面積之和）組合作標準曲線時其線性更好，其回歸方程的線性相關系數r=0.999 6，而單峰的相關系數為R2=0.999 0，經雙峰定量曲線計算，回收率為102.05%，經單峰定量曲線計算，回收率為103.76%，表明雙峰定量具有一定的優化性。

3.3 不同前處理方法比較

經實驗發現，去除酒中的乙醇可減少莧菜紅在酒中的轉化物。經過趕乙醇處理的樣，其回收率明顯減小。但由于國家標準中沒有明確規定去除乙醇的時間和溫度，因此，在確保乙醇不揮干的基礎上進行測試，發現待測物質仍有大量損失。由于葡萄酒中乙醇蒸發所需的時間較難控制，再加上損失的不確定性，省略蒸發這一操作步驟，回收率可得到優化，具體檢測情況見表3。因此，本實驗采取直接進樣法進行測定。

表3 葡萄酒不同前處理加標回收率及精密度表

3.4 標準加入法與標準曲線法結果比較

在本實驗條件下，發現同一樣品采用標準曲線法與標準加入法進行定量，測得的結果存在差異，標準曲線法測得的樣品平均濃度低于標準加入法。標準曲線法測得樣品加標回收率為79.12%～88.23%，標準加入法測得的加標回收率為89.32%～103.76%，標準加入法測得的加標回收率明顯高于標準曲線法，則可證明標準加入法測得的結果更為準確。由于食品類樣品基體一般較為復雜，但待測物含量低，對實驗結果干擾較大，因此選擇標準加入法進行測定，準確度相對較高。

3.5 聚酰胺吸附

本次實驗按照國家標準進行色素提取，發現用聚酰胺進行吸附后，用解吸液解吸，聚酰胺上的色素難以完全洗脫，其標準回收率為75.43%～85.16%，低于直接進樣法。因此本實驗采用直接進樣標準加入法，可省去煩瑣的前處理步驟，提高方法的準確度，減少有機溶劑對環境和人員的危害。

3.6 曲線回歸比較

經實驗發現，對分別濃度配制法和一瓶濃度遞增法進行曲線回歸比較，其結果差距相對較小。分別濃度配制法：分別吸取混合標準使用液2.5 μL、7.5 μL、10.0 μL、12.5 μL于10 mL容量瓶中，用樣品液定容后測定。一瓶濃度遞增法：準確移取2.5 μL標準使用液于10 mL容量瓶中，用樣品液定容至10 mL，混勻，取25 μL進樣測定，即得除空白外的第1點的色譜圖，向容量瓶內加5.0 μL標準使用液，混勻后測定為第2點，同此法分別加入2.5 μL，得第3點和第4點，即得與分別配制法相同的濃度系列。一瓶濃度遞增法使用的實驗器具較少，減少了操作步驟，簡單方便，對于原子吸收、氣相色譜、質譜儀等大型精密儀器均可參考使用。

4 結論

本文參照國家標準對葡萄酒中莧菜紅、胭脂紅進行測定，解決了實際操作中遇到的一系列問題，對測試條件、樣品處理、數值的定量進行合理改進，提高方法精密度和準確度，可應用于酒類樣品中人工合成色素的測定。