糧食真菌毒素含量檢測結果的誤差分析

◎ 于 鶴，申兆燕，王杰夫，劉 暢，楊思成

（1.中央儲備糧阜新直屬庫有限公司，遼寧 阜新 123000；2.黃岡市公共檢驗檢測中心，湖北 黃岡 438000）

真菌毒素是真菌在適宜條件下產生的一種低分子量的次生代謝物，大多數真菌毒素可抑制動物體內蛋白合成，破壞細胞結構，進而影響動物體肝臟、腎臟、造血等組織器官的正常工作，具有較強的致癌、致畸、致突變作用，對人和動物的生存與健康造成了重大威脅[1]。在谷物及其制品中，常見的真菌毒素有黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）、玉米赤霉烯酮毒素（Zearalenone，ZEN）、嘔吐毒素（Deoxynivalenol，DON）等[2]。真菌毒素污染是不可忽視的問題，為防止糧食在流通環節存在質量安全風險，《糧食流通管理條例》中真菌毒素已被列為必檢項目[3]。糧食衛生標準GB 2761—2017中規定，真菌毒素限量指標應符合表1要求[4]。

表1 糧食中真菌毒素限量要求表（單位：μg·kg-1）

糧食生霉粒、霉變粒含量的高低與真菌毒素含量多少無明顯正相關性，不可通過霉變情況判斷真菌毒素含量，真菌毒素檢測值高低主要與糧食是否感染產毒霉菌有關[5]。糧食在生長、運輸、存儲和加工等環節都會受到真菌入侵，在宿主、光照、溫度、水分活度等適宜環境條件下，產毒霉菌會產生真菌毒素，產生的真菌毒素具有隨機性、分布不均—的特點[6]，且真菌毒素通常只有ppm或ppb級別（ppm級別相當于32 kg糧食中的一顆）[7]，致使準確檢測谷物中真菌毒素的含量十分困難。

1 影響糧食真菌毒素含量檢測結果的因素

同其他檢測項目一樣，糧食真菌毒素含量的檢測也包括抽樣、制樣、分析檢測等步驟。每個步驟都會不可避免的引入誤差，對檢測結果造成直接或間接的影響[8]。

1.1 扦樣環節對糧食真菌毒素含量檢測結果的影響

扦樣是糧食真菌毒素檢測的第一步，直接影響檢測結果的準確性，如果扦樣方法不合理、樣品數量不具代表性，任何精密儀器的分析結果將毫無意義。在糧食儲運中常見的扦樣類型有運糧汽車扦樣（對入庫車輛進行自動扦樣器扦樣）和靜態糧倉扦樣（人工對不同扦樣點進行電動吸風機扦樣），見圖1[9]。

圖1 扦樣示意圖

扦樣要做到多點、隨機、均勻，使得每個部位都有相同的概率被取到。《糧食、油料檢驗扦樣、分樣法》（GB 5491—1985）對扦樣方法作出了明確要求，尤其在倉房扦樣中需做到分區設點、分層扦樣[10]，糧庫扦樣點位如圖2所示。

圖2 糧庫扦樣布點示意圖

在高大平房倉的扦樣中，每區面積不超過50 m2，各區設中心4角共5個點，兩區邊界的點為共有點，糧堆邊緣的點設在距邊緣50 cm處；糧堆高度在23 m，分上、中、下3層，上層在糧面下10~20 cm處，中層在糧堆中間，下層在距底部20 cm處，堆高在35 m，應分4層；在圓筒倉扦樣中，每層按圓筒倉直徑分內（中心）、中（半徑的一半處）、外（距倉邊30 cm處）3圈。直徑在8 m以下的，每層按內中外設1、2、4共7個點，直徑在8 m以上的，每層按內中外設1、4、8共13個點。按區按點，從上至下，逐層扦樣。

扦樣點對真菌毒素檢測結果的影響較大，余敦年等[11]對糧倉不同空間位置的稻谷進行檢測后發現，上、中、下層的黃曲霉B1含量均存在差異，近墻部位黃曲霉B1含量和超標率較大，中層黃曲霉B1含量高于其他部位。同時各點受真菌毒素的污染情況不一樣，有些糧堆中受真菌污染的糧食顆粒少，但受污染的顆粒真菌毒素含量極高[12]，致使檢測結果超標。在儲藏過程中，隨著糧堆水分和溫濕度的改變，受侵染的區域還會發生蟲霉交替的演變，適應環境的菌種會更有利于生長，受感染糧粒的真菌毒素含量和類型隨之改變。糧庫扦樣過程中，不同空間位置和不同糧粒受真菌毒素污染程度差異較大，是檢測結果的主要誤差來源。

扦樣量也會對真菌毒素的檢測結果造成差異影響，表2為在一卡車玉米中加標20 μg·kg-1的黃曲霉毒素污染情況[13]。從表2可以看出，在一卡車中扦樣量取4.50 kg，玉米黃曲霉毒素檢測范圍在11.6~28.4 μg·kg-1；在一卡車中扦樣量取0.45 kg，檢測范圍在0~46.9 μg·kg-1。由此可見，適當提高扦樣量可減小檢測結果的誤差。原料扦樣后按照分樣器法進行分樣，分出約1 kg樣品進行混勻[14]，這樣可以保證檢測的最低檢測量和檢測樣品的霉菌毒素的分布均一性。

表2 一卡車玉米中有20 μg·kg-1黃曲霉污染的情況表

1.2 制樣環節對真菌毒素含量檢測結果的影響

樣品的均勻性是制樣環節的主要誤差，在糧食入庫時節，基層檢驗員在使用快捷設備進行真菌毒素檢測時發現，同一樣品的不同粉末檢測結果相差較大，而取同一提取液的檢測結果平行性良好，制粉的均勻性問題給收糧工作帶來很大困擾，尤其是對超標附近的檢測結果難以把控。從真菌毒素在糧食顆粒的分布來看，不同部位含量也有所差異。對一批黃曲霉毒素超標的稻谷進行液相分析，發現碾磨后的精米中黃曲霉毒素B1含量在正常范圍內，糙米中黃曲霉毒素B1含量較高，而糠粉中黃曲霉B1含量最高，且占稻谷籽粒黃曲霉毒素B1含量的90%。為保證樣品的均勻性，需要選擇合適的研磨方式對脫殼后的糙米進行研磨，研磨產生的顆粒足夠小，可使制成的樣品均勻性良好，從而減少平行樣品間的變異性，減小分析誤差。GB 5009.22—2016規定谷物粉碎后的粒徑通過2 mm孔徑試驗篩，在稱樣前建議先攪拌搖勻，再進行下一步的儀器設備分析。

次級分析樣品的取樣量也會對真菌毒素的檢測結果造成影響。王松雪等[15]對總體黃曲霉污染水平為20 ng·g-1的樣品進行薄層色譜分析，發現次級分析樣品的取樣量從50 g提高到100 g，測定結果范圍從（20±36.9）ng·g-1降低為（20±20.5）ng·g-1，適當提高次級分析樣品的取樣量，可減少真菌毒素的分析誤差。在制樣過程中，如果只是簡單地減少樣品量大小，直接取少量的樣品進行研磨，會進一步降低樣品的代表性，在研磨前建議用四分法分出約100 g樣品進行脫殼、制粉。

1.3 分析方法對糧食真菌毒素含量檢測結果的影響

近年對分析檢測過程中的誤差研究較多，主要集中在送檢到實驗室后樣品的提取、凈化、分離和檢測上，目前已建立了一系列的檢測標準和方法，常見的有高效液相色譜法、免疫層析法等，各種方法的特點如表3所示。

表3 不同分析方法檢測真菌毒素含量比較表

免疫層析法法更適用于批量樣品的初篩，容易出現假陰性和假陽性結果，難以用于準確定量分析。在定量分析檢測中，高效液相色譜法具有精準度高、檢出限低、靈敏度強的優勢，大大減少了分析檢測過程中引入的誤差，是糧油質檢機構出具檢測報告的常用方法。另外，近年來全自動免疫磁珠凈化儀等前處理裝置的研發，避免了液相過親和柱、氮吹等前處理步驟，解決了液相前處理操作煩瑣的問題[23]。隨著新技術的發展，真菌毒素檢測研究開始出現在納米材料和識別原件上，運用微流控技術、拉曼光譜等新技術構建真菌毒素指紋圖譜，結合智能化手機可實現真菌毒素的實時在線監測[24]，但作為新技術在真菌毒素的準確定量分析上還存在不足，需要進一步研究和完善。

2 結語

目前在分析方法上，運用大型精密設備基本可避免出現真菌毒素檢測的誤差問題，然而，扦樣和制樣過程中引入的誤差仍亟待解決。現有的糧油扦樣標準對于扦樣方法和扦樣量只做了簡單介紹，實際工作中難以對不同運糧車輛、不同倉型和倉容的糧庫在扦樣要求上形成統一。因此，還需要進一步規范真菌毒素檢測的具體扦樣步驟。在制樣過程中，人工分樣、機械研磨等步驟也都會造成真菌毒素分布不均一，而引入具備充分混勻樣品能力的自動分樣器和連續粉碎裝備可減少誤差來源。只有完善扦樣和制樣過程中的具體規定，避免真菌毒素分布分布不均一問題，才能從根本上減小糧食真菌毒素檢測的誤差。