高效液相色譜法測定啤酒中嘌呤含量

2021-10-14 02:25:42鄭麗婷王瑞恒樂虹雯陳杏洲

現代食品 2021年15期

◎ 鄭麗婷，王瑞恒，樂虹雯，陳杏洲

（武漢工程大學環境生態與生物工程學院，綠色化工過程教育部重點實驗室，湖北武漢 430205）

啤酒是以麥芽和水為主要原料，并添加啤酒花、酵母發酵而成的一種發酵酒，因其口感清爽、香氣宜人而受到人們的喜愛[1]。研究發現，市場所售的國內外常見啤酒中嘌呤含量普遍較高[2]，該物質在人體中最終代謝為尿酸，尿酸若在體內大量積累，極易引發痛風[3]。隨著全球啤酒消費量的增加，飲用高嘌呤啤酒所帶來的問題也逐漸突顯。

目前，嘌呤類物質檢測方法多采用高效液相色譜法[4]、反相離子對色譜法[5]、毛細管電泳法[6]，其中高效液相色譜法因操作簡單、快速、靈敏、準確而廣受青睞。本文旨在建立檢測啤酒中嘌呤含量的高效液相色譜法，為啤酒樣品中嘌呤的定量檢測提供參考，促進啤酒行業健康、快速、穩定的發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤標準品，色譜級（純度≥99.9%），上海源葉生物科技有限公司；磷酸二氫鉀、濃硫酸、甲醇，色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；實驗用超純水，上海和泰儀器有限公司純水機制備。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；Ultimate AQ-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），月旭科技（上海）股份有限公司；pH計，上海儀電科學儀器有限公司；紫外-可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；電子分析天平，常熟市雙杰測試儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制方法

準確稱取腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、次黃嘌呤（H）和黃嘌呤（X）4種嘌呤標準品各25 mg，用超純水溶解并定容至25 mL，加入少量氫氧化鈉溶液（10 mol·L-1）助溶，配制成1 g·L-1的標準溶液，并用0.45 μm濾膜過濾，置于4 ℃冰箱冷藏保存，使用時稀釋到一定的濃度。使用前看是否存在白色懸浮物，若存在需要重新配制。

1.3.2 標準曲線繪制

分別取體積相同的上述溶液混合，用超純水稀釋至100 mg·L-1、50 mg·L-1、25 mg·L-1、10 mg·L-1、5 mg·L-1、2.5 mg·L-1和 1.0 mg·L-1，用 0.22 μm 濾膜過濾，上機檢測，以樣品質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制4種嘌呤的標準曲線。

1.3.3 樣品前處理

取30 mL啤酒樣品于50 mL離心管中，在5 000 r·min-1下離心15 min，將離心后的啤酒倒入敞口三角燒瓶中，經超聲除氣15 min。

取5 mL的除氣啤酒樣品于25 mL的試管中，加入3 mol·L-1的硫酸溶液5 mL，加塞后，立即置于100 ℃恒溫水浴鍋中，在100 ℃下水解10 min，然后迅速冰水浴冷卻。用10 mol·L-1的氫氧化鉀溶液調整pH到2～8，然后用濾紙過濾，并用蒸餾水洗滌殘渣，濾液定容到25 mL，再用0.22 μm濾膜過濾，濾液進入高效液相色譜儀分析。

1.3.4 色譜檢測條件

色譜柱：Ultimate AQ-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為 0.02 mol·L-1KH2PO4-H3PO4緩沖溶液（pH=3.6）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL。

1.4 數據處理

采用Agilent 1260高效液相色譜儀自帶數據處理系統采集數據，本文所有色譜圖和折線圖均使用Origin 2019及Excel軟件繪制，數據表示形式、精密度、準確度結果均由Excel辦公軟件處理。

2 結果與分析

2.1 不同液相條件分析

2.1.1 流動相選擇

由色譜分離原理可知，流動相的選取直接影響著4種嘌呤的分配比例，進而影響混合物的分離效果。陳月菊[7]在測定食用菌中嘌呤物質的含量時選擇甲醇∶水=5∶95作為流動相。程慶紅等[8]在測定蝦仁和牡蠣中嘌呤類物質的含量時也選擇甲醇∶水=5∶95作為流動相，并發現當甲醇濃度高于5%時，次黃嘌呤和黃嘌呤不能完全分開。劉鎮等[9]在測定黃酒中嘌呤含量時選擇0.007 mol·L-1的磷酸二氫鉀（pH=4.0）作為流動相，且分離效果良好。王靜螢等[10]利用0.02 mol·L-1的磷酸二氫鉀分別測定了啤酒和肉類中嘌呤的含量。

參考以上色譜條件分別選用甲醇∶水=5∶95、0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀（pH=3.6）、0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀（pH=3.6）-甲醇（V∶V=98∶2）、0.008 mol·L-1磷酸二氫鉀（pH=4.5）作為流動相，流速均為1.0 mL·min-1，柱溫為25 ℃，測定嘌呤標準品中4種嘌呤的含量，結果如圖1所示。

圖1 不同的流動相參數下4種嘌呤的分離效果圖

當選擇甲醇∶水=5∶95、0.008 mol·L-1的磷酸二氫鉀（pH=4.5）作為流動相時，鳥嘌呤和腺嘌呤出峰時間幾乎相同；當選擇0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀（pH=3.6）∶甲醇（V∶V=98∶2）溶液作為流動相時，與單純使用緩沖鹽作為流動性時相比，4種嘌呤的保留時間均減小，但鳥嘌呤和腺嘌呤的保留時間相隔太小，分離效果不好，已有研究發現向流動相中加入甲醇對樣本中嘌呤的分離影響較小，甚至會使分離效果變差[11-12]；當選擇0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀（pH=3.6）作為流動相時，4種嘌呤分離度好，且峰形標準，故選其作為流動相。

2.1.2 流動相pH選擇

在使用磷酸二氫鉀溶液作為流動相時，不同研究者選用的pH有所差異[13-14]。嘌呤是一種弱堿性物質，且有極性，流動相的pH會影響其極性，從而影響其存在形態。流動相pH影響嘌呤在色譜柱中停留時間和色譜峰形狀，對4種嘌呤的分離有很大的影響[15]。因此本實驗通過改變磷酸二氫鉀緩沖溶液的pH，探究4種嘌呤在pH為3.0、3.2、3.4、3.6、3.8和4.0的0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液的流動相下的分離情況，結果如圖2所示。pH在3.0～4.0時，隨著pH增大，4種嘌呤的保留時間增長；pH小于3.6時腺嘌呤與鳥嘌呤的保留時間基本重合，無法分離；當pH增大到3.8時腺嘌呤和次黃嘌呤的保留時間接近；當pH增加到4.0時次黃嘌呤的出峰時間延后，與黃嘌呤接近。當pH=3.6時，4種嘌呤分離情況最佳，故確定流動相pH為3.6。

圖2 4種嘌呤在不同pH的0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀條件下的分離效果圖

2.1.3 柱溫選擇

柱溫也會影響色譜柱的分離效果。對液相色譜來說，色譜柱處于較高溫度的環境下可以加快樣本中嘌呤混合物的分離速度，但分辨率和待分離物質的保留時間均會受到影響。本實驗研究了柱溫為22 ℃、25 ℃、28 ℃和30 ℃時4種嘌呤的分離效果，結果如圖3所示。在本實驗所研究的溫度范圍內，溫度越低，保留時間越長。當溫度大于25 ℃時，腺嘌呤和次黃嘌呤分離度不高，是因為當溫度升高時，各組分的分配系數變小，分離度隨之減小，越不好分開；當溫度小于25 ℃時，鳥嘌呤和腺嘌呤沒有完全分離，分離效果差，故選擇柱溫為25 ℃。

圖3 4種嘌呤在不同溫度下的分離程度圖

2.1.4 波長選擇

4種嘌呤具有較強的紫外吸收特性。在200～400 nm波長范圍內，對4種嘌呤混合標準品進行掃描，結果如圖4所示。掃描結果顯示腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤及次黃嘌呤最大吸收波長分別為268 nm、274 nm、277 nm和259 nm。目前測定嘌呤類物質時多選擇254 nm波長[16-17]，但也有研究者選擇了其他波長[18-19]，測定結果差異不大，故本研究選擇檢測波長為254 nm。

圖4 嘌呤紫外吸收光譜圖

2.2 嘌呤標準曲線及回歸方程

對一系列梯度稀釋后的嘌呤標準混合溶液進行液相色譜分析，結果如圖5所示，以樣品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，線性方程及相關系數如表1所示。結果顯示，采用2.1最終確定的色譜條件，4種嘌呤能夠很好的分開，且在1.0～100.0 mg·L-1質量濃度范圍內線性關系良好，所有組分相關系數（R）均高于0.999 0。按3倍信噪比計算，檢出限為0.010 ～ 0.030 mg·L-1。