化腐再生法調控iNOS、IL-1β、CD16的表達促進糖尿病大鼠筋之血化*

孫旭，孫瀚馳，徐強，朱朝軍，劉瀟鴿，宋子豪，李萌，劉振雷，張朝暉

1.天津中醫藥大學，天津 301617；2.天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300250

糖尿病足破潰經常深達肌腱，且感染會沿著肌腱蔓延，患者被迫截肢甚至失去生命。因此，糖尿病足潰瘍中對于肌腱的感染處理是治療成功與否的關鍵。臨床發現，經化腐再生治療后，變性但尚未失去活性的肌腱表層上可見散在分布的新生肉芽島，并逐漸生長，最終暴露的肌腱被新生的肉芽組織覆蓋，稱之為“筋之血化”［1-2］，經過此過程后創面逐漸愈合。前期的研究發現，筋之血化的出現是建立在糖尿病足創面微環境穩態形成之后，能加速創面愈合［3-7］。在前期研究的基礎上，本文通過觀察誘導型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、CD16的表達，以期了解筋之血化過程的變化規律，對于提高糖尿病足創面修復水平，豐富中醫外治理論提供科學依據。

1 材料

1.1 動物30只SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質量（250±20）g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK-（軍）2014-2018，實驗倫理審查號：20180929004。動物飼養在溫度（20±3）℃，濕度37%～48%，12 h/12 h明暗交替的環境下，正常飲食飲水。

1.2 藥物與試劑橡皮生肌膏［藥物成分：象皮（制）、血余、龜甲、地黃、當歸、石膏、爐甘石、蜂蠟，天津達仁堂京萬紅藥業有限公司，國藥準字：Z12020345］；復方菠蘿蛋白酶撒布（汕頭市橄欖枝制藥有限公司，規格：100 g·L-1，國藥準字：H44024825）；德濕潔水膠體傷口敷料（德國保赫曼公司，國械注進：20172641570）；醫用凡士林油紗條（河南新飄安高科股份有限公司，國械注準：20153640846）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，美國Sigma公司，貨號：S0130）；注射用青霉素鈉［華北制藥集團動物保健品有限責任公司，規格：2.4 g（400萬單位），獸藥字：（2015）030201248］。iNOS、IL-1β、CD16 ELISA試劑盒（加拿大Hermes Criterion Biotechnology公 司，貨 號：RH0012、RH0053、RH0026）；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA，pH 8.0）抗原修復液、EDTA（pH 9.0）抗原修復液（美國Abcam公司，貨號：ab128983、ab93680、ab93684）；檸檬酸（pH 6.0）抗原修復液、蘇木素染液（美國Abcam公司，貨號：ab64214、ab143166）；中性樹膠（北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號：ZLI-9555）；iNOS、IL-1β一抗（美國Abcam公司，貨號：ab3523、ab9722）；CD16一抗（美國Thermo Fisher Scientific公司，貨號：MAI-84008）；HRP標記的山羊抗兔鼠通用二抗（美國Agilent公司，貨號：K5007）；免疫組化試劑盒（美國Agilent公司，貨號：K3468）；牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA，北京索萊寶生物科技有限公司，貨號：A8020）。

1.3 儀器MULTISKAN MK3型全自動多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；DH4000A型電熱恒溫培養箱（天津泰斯特儀器有限公司）；ASP300S型全自動組織脫水機、EG1160型一體式石蠟包埋機、RM2235型切片機（德國徠卡儀器有限公司）；E200型雙目生物顯微鏡、ECLIPSE 90i型正置熒光顯微鏡、NIS-Elements F 2.20成像系統（日本Nikon公司）；MH-1型微型漩渦振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；TD5型低速醫用離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）。

2 方法

2.1 造模分組及藥物干預大鼠適應性喂養3 d后，以3.5 mg·kg-1的劑量腹腔注射STZ，以3 d后血糖值≥16.7 mmol·L-1為糖尿病模型造模成功。將糖尿病大鼠背部剃毛后，常規消毒，在無菌條件下，用外科方法在大鼠腰背部脊柱兩側制作2個伴肌腱損傷的潰瘍創面，取25%的冰醋酸50μL滴到創面上，以潰瘍創面形成并伴有2個變性壞死肌腱為肌腱暴露創面模型成功［8］。連續3 d肌注青霉素4萬單位預防感染造成死亡。具體造模過程如圖1。造模成功的大鼠隨機分為模型組、陽性對照組、治療1組、治療2組、治療3組，并于次日開始藥物干預。模型組應用凡士林油紗外敷，陽性對照組應用水凝膠外涂，治療1組應用橡皮生肌膏外敷，治療2組外用菠蘿蛋白酶撒布，治療3組應用橡皮生肌膏外敷聯合菠蘿蛋白酶撒布，每日換藥1次，連續21 d。

圖1 造模過程

2.2 ELISA法檢測血清中iNOS、IL-1β、CD16的水平分別于治療3 d、7 d、14 d、21 d后眼眶采血，每次1.5 mL，于抗凝管中混勻，離心半徑10 cm，3 000 rpm·min-1離心10分鐘，取上清。嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，應用雙抗體夾心法測定大鼠血清中iNOS、IL-1β、CD16的水平。

2.3 免疫組化檢測創周組織iNOS、IL-1β、CD16的表達將創周組織做石蠟切片，脫蠟后進行抗原修復，并于阻斷內源性過氧化物酶后進行BSA封閉，加入一抗和二抗孵育后，DAB顯色，復染細胞核后脫水封片。每組內每張切片隨機挑選至少3個視野進行拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。應用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為陽性判定的統一標準，對每張照片進行分析得出每張照片的積分光密度值（integrated optical density，IOD）及組織的像素面積（AREA），并求出平均光密度值（average optical，AO），AO＝IOD/AREA，AO值越大表明陽性表達水平越高。

2.4 統計學方法應用SPSS 22.0統計學軟件對實驗數據進行處理，計量數據以均數±標準差（±s）表示。組間比較符合正態分布且方差齊的數據采用單因素方差分析，并用LSD進行檢驗后多重比較，不滿足上述條件的數據選擇秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠血清中iNOS的水平ELISA法檢測各組大鼠不同時間點血清中iNOS的水平。與模型組比較，治療3 d后，治療3組大鼠血清中iNOS的水平顯著升高（P＜0.01）；而治療21 d時，治療2組和治療3組大鼠血清中iNOS的水平顯著降低（P＜0.05），大鼠血清中iNOS水平的變化趨勢與陽性對照組一致，均呈現先升高后降低的趨勢。見表1。

表1 各組大鼠血清中iNOS的水平 （±s，ng·L-1）

表1 各組大鼠血清中iNOS的水平 （±s，ng·L-1）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

3 d 7 d 14 d 21 d模型組 6 220.61±22.65 307.21±44.10 351.31±02.07 36組別 n 8.48±49.75陽性對照組 6 466.64±63.02** 575.53±92.36** 651.96±84.16* 266.72±52.97*治療1組 6 261.52±74.73 311.06±66.92 400.76±79.32 323.23±58.47治療2組 6 294.80±71.34 330.53±84.90 388.85±81.61 270.83±55.83*治療3組 6 457.99±80.82** 563.81±80.63** 663.39±38.61** 244.60±46.26**

3.2 各組大鼠創周組織iNOS的蛋白表達水平免疫組化分析各組大鼠創周組織iNOS蛋白在不同時間點的表達情況。與模型組相比，治療3 d后，治療3組iNOS免疫組化染色呈深褐色強陽性，且部分連成片狀表達，AO值顯著增高（P＜0.05），而治療周期延長后，iNOS蛋白表達水平呈現先升高后降低的趨勢，與陽性對照組一致。結果見表2，圖2。

圖2 治療3 d后各組大鼠創周組織iNOS蛋白表達的免疫組化染色圖（×200）

表2 各組大鼠創周組織中iNOS蛋白的表達水平 （±s，/100）

表2 各組大鼠創周組織中iNOS蛋白的表達水平 （±s，/100）

注：與模型組比較，*P＜0.05

組別 n 3 d 7 d 14 d模型組6 1.78±0.51 3.31±0.41 3.20±0.83陽性對照組6 3.16±0.68 4.51±1.40 2.00±0.31治療1組 6 2.81±0.50 3.98±1.13 4.43±0.59治療2組 6 2.12±1.06 3.80±0.65 3.78±1.18治療3組 6 3.83±1.44*5.28±2.24 2.69±0.44

3.3 各組大鼠血清中IL-1β的水平ELISA法檢測各組大鼠不同時間點血清中IL-1β的水平。與模型組比較，治療3 d后，治療3組大鼠血清中IL-1β水平顯著增高（P＜0.05），而治療21 d后，治療3組大鼠血清中IL-1β水平顯著降低（P＜0.01），且治療3組大鼠血清中IL-1β水平的變化趨勢與陽性對照組一致。見表3。

表3 各組大鼠血清中IL-1β的水平 （±s，ng·L-1）

表3 各組大鼠血清中IL-1β的水平 （±s，ng·L-1）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

3 d 7 d 14 d 21 d模型組 6 11.19±1.61 13.23±1.62 17.81±2.27 16.47±1.組別 n 52陽性對照組 6 16.56±2.39* 22.21±3.08* 28.33±2.22 10.83±2.36**治療1組 6 12.80±2.94 17.36±3.53 22.70±2.83* 10.30±1.72治療2組 6 13.16±2.14 17.80±1.76 22.37±2.54* 9.92±1.52治療3組 6 16.95±2.65** 21.47±2.36* 28.08±2.49* 10.38±2.39**

3.4 各組大鼠創周組織IL-1β的蛋白表達水平免疫組化分析各組大鼠創周組織IL-1β蛋白在不同時間點的表達情況。與模型組相比，治療3 d時，治療3組IL-1β免疫組化染色呈深褐色強陽性，且部分連成片狀表達，AO值顯著增高（P＜0.05），隨著治療周期延長，IL-1β的蛋白表達水平呈先升高后降低趨勢。結果見表4，圖3。

圖3 治療3 d后各組大鼠創周組織IL-1β表達的免疫組化染色圖（×200）

表4 各組大鼠創周組織IL-1β蛋白的表達水平 （±s，/100）

表4 各組大鼠創周組織IL-1β蛋白的表達水平 （±s，/100）

注：與模型組比較，*P＜0.05

3 d 7 d 14 d模型組組別 n 6 1.48±0.29 2.85±0.61 4.19±2.43陽性對照組6 3.41±1.83 5.28±1.46 1.00±0.68*治療1組 6 2.12±1.74 4.33±2.97 4.60±0.69治療2組 6 2.18±0.66 4.14±1.53 3.83±2.31治療3組 6 3.66±1.22*5.51±2.69 1.59±0.45

3.5 各組大鼠血清中CD16的水平ELISA法檢測不同時間點各組大鼠血清中CD16水平。與模型組比較，治療3 d后，治療3組大鼠血清中CD16水平顯著增高（P＜0.05），而治療21 d時，治療1、2、3組大鼠血清中IL-1β水平顯著降低（P＜0.05），且治療3組大鼠血清中CD16水平的變化趨勢與陽性對照組一致。見表5。

表5 各組大鼠血清中CD16的水平 （±s，ng·L-1）

表5 各組大鼠血清中CD16的水平 （±s，ng·L-1）

注：與模型組比較，*P＜0.05

組別 n 3 d 7 d 14 d 21 d模型組 6 60.20±13.60 79.45±13.01 95.31±10.46 98.00±16.26陽性對照組 6 82.97±13.91* 115.35±17.01** 153.13±8.26** 58.46±13.69*治療1組 6 68.47±9.19 94.90±17.10 120.70±15.08 73.78±18.94*治療2組 6 68.07±16.20 101.09±3.95 121.58±11.08 68.60±27.39*治療3組 6 80.31±9.49* 117.12±13.84** 156.32±11.99** 58.90±15.73*

3.6 各組大鼠創周組織CD16蛋白表達水平免疫組化分析各組大鼠創周組織CD16蛋白在不同時間點的表達情況。與模型組相比，治療3 d時，治療3組大鼠創周組織免疫組化染色呈深褐色強陽性，AO值顯著增高（P＜0.05），隨著治療周期延長，CD16蛋白表達水平呈先升高后下降的趨勢。見表6，圖4。

表6 各組大鼠創周組織CD16蛋白的表達水平 （±s，/100）

表6 各組大鼠創周組織CD16蛋白的表達水平 （±s，/100）

注：與模型組比較，*P＜0.05

3 d 7 d 14 d模型組組別 n 6 0.98±0.29 1.81±0.48 3.31±2.54陽性對照組 6 2.20±0.81*4.70±1.96 0.84±0.55治療1組 6 1.70±0.60 3.22±1.28 4.65±2.03治療2組 6 1.39±0.35 2.74±1.38 3.64±0.80治療3組 6 3.41±2.04*4.89±3.54 1.60±0.29

圖4 治療3 d后各組大鼠創周組織CD16表達的免疫組化染色圖（×200）

4 討論

糖尿病足是糖尿病嚴重的并發癥之一［9］。由于皮膚修復能力受損、局部微循環較差、有效治療滯后等原因，病原體和病原微生物逐步侵襲周圍組織。當感染沿著肌腱蔓延時，會向肢體近端發展，使得創面在短時間內進一步擴大，毒素大量生成并入血，患者被迫截肢甚至威脅生命［10-14］。因此，在糖尿病足的治療中，肌腱感染的處理尤為重要。大量的臨床實踐發現，在肌腱變性壞死早期，應用化腐再生法，即菠蘿蛋白酶靶向去除壞死肌腱及組織，結合橡皮生肌膏創造濕性愈合環境，可有效控制感染蔓延，促進肉芽和皮膚組織原位再生。治療早中期會刺激機體產生炎癥及免疫反應，誘發巨噬細胞產生和釋放炎癥因子，而本研究主要觀察iNOS、IL-1β、CD16等因子在筋之血化過程中的表達。

創面修復是個復雜的動態過程，炎癥反應是第一階段。巨噬細胞作為體內重要的吞噬和抗原呈遞細胞，在機體處理外源性病原微生物方面發揮重要作用，是創傷愈合和組織修復過程的“總指揮”［15］。M1型（經典活化型）巨噬細胞在早期分泌大量炎癥因子和炎癥趨化因子，預防細菌的侵入，吞噬清除表面的壞死組織及病原體，以加速創面炎癥反應進程［16］。而在創傷后期主要以M2型（替代活化型）巨噬細胞主導，促進組織的修復［17］。因此，巨噬細胞促使炎癥期向增殖修復期過渡的過程，被認為是傷口愈合的重要防線［18］。

iNOS是一氧化氮合酶的亞型，主要在炎性細胞及成纖維細胞中表達。在氧化應激反應中iNOS表達增加，一氧化氮（nitric oxide，NO）通過iNOS釋放，抑制浸潤肉芽腫參與炎癥反應，調節膠原形成［19-20］。本實驗結果表明，早期時治療3組大鼠血清中iNOS的水平明顯升高，并呈現不斷增長的趨勢，至治療21 d后，iNOS的水平明顯下降。免疫組化結果同樣顯示，iNOS蛋白在早期高表達，而后期出現下降趨勢，表明化腐再生法促使iNOS的表達和釋放在早期出現，縮短免疫調控進程，后期抑制iNOS的產生和釋放。

IL-1β作為炎癥反應中免疫介導因子之一，也是傷口愈合的重要介質［21］。它主要由單核巨噬細胞產生，可誘導巨噬細胞向促炎表型M1型轉化［22］。IL-1β在正常生理條件下基本不表達，但在損傷組織中高表達［23］，此時IL-1β分泌到細胞外，誘發并放大炎性反應［24］。在本實驗中，早期時，治療3組大鼠血清中IL-1β的水平明顯升高，至治療21 d時，IL-1β的水平明顯下降。免疫組化檢測發現，治療3組大鼠創周組織IL-1β蛋白同樣呈現早期高表達，而后期出現下降趨勢，提示IL-1β在早期可介導局部抗炎，參與免疫反應，吞噬及清除壞死組織。推測，化腐再生法可以促使IL-1β分泌，調控免疫反應。

CD16是自然殺傷細胞常見的表面標記之一，屬于免疫球蛋白超家族成員，具有連接體液免疫和細胞免疫的橋梁作用［25］。CD16通過調動炎癥細胞和活化受體趨化因子加強炎性反應［26］。研究表明，CD16可以啟動中性粒細胞的吞噬作用，避免炎癥擴散［27］。本研究結果顯示，治療早期，治療3組大鼠血清中CD16的水平呈現逐漸升高的趨勢，在治療21 d時CD16的水平明顯下降。免疫組化結果顯示，創周組織CD16的蛋白表達同樣以早期高表達為主。推測化腐再生法在免疫反應的早中期可針對性提高CD16活性，促進免疫炎癥反應進程。

化腐再生法主要藥物為橡皮生肌膏和復方菠蘿蛋白酶。既往研究表明，橡皮生肌膏是良好的免疫促進劑，外用對巨噬細胞有明顯的激活和吞噬作用［28-29］。菠蘿蛋白酶作為酶類清創劑的一種，具有一定的抗炎作用，在體外能針對性地激活巨噬細胞，二者協同維持創面的微環境穩態，靶向作用于壞死肌腱與筋膜，促進肉芽組織生長，出現“筋之血化”，為創面修復提供必要環境［30］。通過本研究發現，化腐再生法通過局部藥物的復合外用，使M1型巨噬細胞因子iNOS、IL-1β、CD16在早中期針對性地高表達，加快炎癥反應進程，為后期組織重塑提供基礎。

綜上，通過觀察免疫炎性因子iNOS、IL-1β、CD16在糖尿病潰瘍創面不同時間的作用規律，提示化腐再生法具有雙重調節作用，調控糖尿病潰瘍創面筋之血化過程，為中醫藥互補外科清創治療，加快糖尿病潰瘍的筋之血化進程以促進創面愈合提供依據。