薯蕷皂苷對弗氏佐劑誘導類風濕關節炎大鼠的影響*

劉佳鈺，李銳，周威，張光偉，倪丹紅，劉丹，李娟

1.西安市第五醫院，陜西 西安 710082；2.西安醫學院，陜西 西安 710021

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種病因不明的慢性炎性疾病，以侵蝕關節滑膜慢性炎癥為主要臨床表現，嚴重時可發生關節損傷、畸形或殘疾，具有病程長、遷延難愈、致殘率高等特點，增加患者的醫療負擔，降低生活質量［1］。目前，治療RA的藥物主要是拮抗不同炎癥通路的生物制劑，如依那西普、妥珠單抗等。臨床治療費用昂貴，且只對部分患者有效，故迫切需要療效肯定且不良反應小的藥物。

薯蕷皂苷是廣泛存在于薯蕷科、百合科和石竹科等中藥中的呋甾烷醇皂苷，可用于治療多種免疫疾病［2］。研究發現，薯蕷皂苷或甲基化薯蕷皂苷通過抑制白細胞介素-1β（interleukin1-β，IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、環氧化酶-2（cyclooxyganese-2，COX-2）和前列腺素-E2（prostaglandin E2，PGE2）等促炎細胞因子，從而抑制炎癥反應［3-4］。然而，薯蕷皂苷對RA的抗炎作用報道較少。本研究應用完全弗氏佐劑（complete freund′s adjuvant，CFA）誘導RA大鼠模型，觀察薯蕷皂苷對其影響，旨在探討薯蕷皂苷治療RA可能的作用機制，以期為后續相關探索工作奠定基礎。

1 材料

1.1 動物40只SPF級6周齡SD雄性大鼠，體質量200～220 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2012-0001。飼養于西安交大醫學院實驗動物中心，使用許可證件號：SCXK（陜）2015-0001。自由飲食，室溫（24±1）℃，濕度（55±5）%，每日7∶00～19∶00光照。本研究獲得陜西師范大學動物倫理委員會批準，倫理批號：20160901。

1.2 藥物與試劑薯蕷皂苷（純度＞98%，成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-15081101）。CFA（美國Sigma公司，貨號：068K8772）；PGE2 ELISA試劑盒（上海通蔚生物科技有限公司，批號：385r1229）；SYBR ExScript qRT-PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司，批號：DRR039s）；Triol RNA試劑盒（日本Takara公司，批號：PK0542）；Easy-Script First-Strand cDNA Synthesis Mix（日本Takara公司，批號：AIG1952A）；PCR定量試劑盒（日本Takara公司，批號：H2001081）。

1.3 儀器Vasrioskan Flash型全波長多功能酶標儀（美國Thermo公司）；5450型離心機（德國Eppendorf公司）；TP1020型脫水裝置（德國Leica公司）；RM2235型切片機（德國Leica公司）；YD-AB型烘烤機（浙江金華益迪公司）；DHG-9203型恒溫干燥鼓風干燥機（上海精密實驗設備廠）；Shandon Gemini型染色機（美國Thermo公司）；DP2-BSM型病理圖像采集系統（日本Olympus公司）；足趾容量測量儀（意大利UGO公司）；7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

2 方法

2.1 大鼠分組及造模將40只大鼠隨機均分為對照組、模型組、薯蕷皂苷低劑量（50 mg·kg-1）組、薯蕷皂苷中劑量（100 mg·kg-1）組、薯蕷皂苷高劑量（200 mg·kg-1）組，每組8只。除正常組外，其余大鼠在左后肢皮下注射100μL CFA復制RA模型［5-6］，對照組注射等體積的生理鹽水。免疫1周后，連續灌胃相應的藥物15 d。

2.2 關節炎程度的評估分別于給藥第5天、第10天、第15天，觀察并記錄大鼠一般情況，包括大鼠的體質量、飲食狀況、毛發、整體狀態及關節紅腫情況等；同時用足趾容量測量儀測量小鼠足爪趾體積，評估關節炎程度［6］。

2.3 ELISA法檢測大鼠血清PGE2水平給藥結束后，用體積分數7%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠腹主動脈取血，3 000 r·min-1離心10 min，取血清，ELISA法檢測大鼠血清PGE2水平。

2.4 RT-qPCR法檢測IL-1βmRNA、TNF-α mRNA、COX-2m RNA、I L-6 m RNA水平 取上述大鼠血清，用Trizol試劑提取總RNA，逆轉錄反應體系為50μL，反應條件：37℃15 min，85℃5 s。擴增反應體系25μL，反應條件：95℃×30 s、95℃×30 s、60℃×40 s（共40個循環）、65℃×5 min。實驗重復3次。采用相對定量法（2-ΔΔCT法）計算相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5 大鼠關節組織病理學檢查每組隨機選3只大鼠，取血后切取后肢踝關節，分離周圍軟組織，置于40 ng·L-1多聚甲醛中，用于后續組織病理學檢測。將大鼠關節組織用不同濃度的乙醇逐級脫水，二甲苯透明，包埋，切片，其厚度大約為4μm，再對其進行脫蠟處理，染色試劑行蘇木素-伊紅（HE）染色。顯鏡下觀察大鼠關節組織病理學變化。

2.6 統計學方法采用SPSS 21.0軟件對數據進行分析，計量數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較用LSD法，方差不齊時用Dunnett′s T法。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠的一般情況對照組大鼠狀態良好，毛色光滑，飲食及排便正常，活動力良好；模型組大鼠活動和進食均減少，毛色較暗、干枯，對刺激的反應較為遲鈍；薯蕷皂苷低、中、高組大鼠全身癥狀較模型組減輕，但是精神狀況一般，食欲和活動力增加，體表毛發光澤較好。

3.2 薯蕷皂苷對RA模型大鼠體質量的影響給藥前，與對照組比較，模型組及薯蕷皂苷低、中、高劑量組大鼠體質量明顯降低（P＜0.05）。給藥第5天、第10天、第15天，與對照組比較，模型組大鼠體質量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，薯蕷皂苷低、中、高劑量組大鼠體質量明顯升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠不同時間段的體質量比較 （±s，g）

表2 各組大鼠不同時間段的體質量比較 （±s，g）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 n 給藥前 給藥第5天 給藥第10天 給藥第15天.21±10.16模型組 8 248.09±2.87* 284.26±1.12* 294.70±1.68* 309.49±2.08*薯蕷皂苷低劑量組 8 248.35±2.76* 287.25±2.76＃ 298.65±2.62＃ 315.80±1.96＃薯蕷皂苷中劑量組 8 249.58±3.04* 296.98±3.13＃ 306.55±2.34＃ 328.18±2.13＃薯蕷皂苷高劑量組 8 248.86±1.98* 298.72±2.37＃ 324.48±2.46＃ 393.03±2.55對照組 8 328.33±5.71 374.18±10.52 392.04±12.45 421＃

3.3 薯蕷皂苷對RA模型大鼠關節體積的影響給藥前，與對照組比較，模型組大鼠足趾體積明顯增大（P＜0.05）。第5天、第10天、第15天，與對照組比較，模型組大鼠足趾體積明顯增大（P＜0.05）；與模型組比較，薯蕷皂苷低、中、高劑量組大鼠足趾體積明顯減小（P＜0.05）。見圖1、表3。

表3 各組大鼠不同時間段的關節體積比較 （±s，mL）

表3 各組大鼠不同時間段的關節體積比較 （±s，mL）

注：對照組比較，*P＜0.05，模型組比較，＃P＜0.05

組別 n 給藥前 第5天 第10天 第15天±0.014模型組 8 0.798±0.045* 0.623±0.047* 0.582±0.055* 0.411±0.042*薯蕷皂苷低劑量組 8 0.654±0.058* 0.585±0.059＃ 0.557±0.076＃ 0.361±0.041＃薯蕷皂苷中劑量組 8 0.692±0.053* 0.565±0.015＃ 0.528±0.080＃ 0.334±0.054＃薯蕷皂苷高劑量組 8 0.680±0.088* 0.536±0.024＃ 0.508±0.063＃ 0.313±0.048對照組 8 0.087±0.010 0.121±0.032 0.177±0.011 0.197＃

圖1 薯蕷皂苷對CFA誘導關節炎大鼠關節體積的影響

3.4 薯蕷皂苷對RA模型大鼠血清炎性因子水平的影響與對照組比較，模型組大鼠血清IL-1βmRNA、TNF-αmRNA、COX-2 mRNA、IL-6 mRNA水平顯著升高（P＜0.01，P＞0.001）；與模型組比較，薯蕷皂苷低、中、高劑量組大鼠血清IL-1βmRNA、TNF-αmRNA、COX-2 mRNA、IL-6 mRNA水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），且呈劑量依賴性。見圖2。

圖2 薯蕷皂苷對RA模型大鼠血清炎癥因子的影響

3.5 薯蕷皂苷對RA模型大鼠PGE2表達水平的影響與對照組比較，模型組大鼠血清PGE2水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，薯蕷皂苷低、中、高劑量組大鼠血清PGE2水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），且呈劑量依賴性。見圖3。

圖3 薯蕷皂苷對RA模型大鼠血清PGE2水平的影響

3.6 對PA模型大鼠踝關節組織病理學改變的影響對照組大鼠關節滑膜平滑完整，結構清晰，無滑膜增生及炎癥細胞；模型組大鼠關節結構粗糙，滑膜細胞增生顯著，可見大量淋巴細胞浸潤并侵入下層軟骨；薯蕷皂苷低、中、高劑量組大鼠踝關節炎癥及浸潤到關節區淋巴細胞的數目減少，且呈劑量依賴性。見圖4。

圖4 大鼠踝關節組織病理變化（HE染色，×200）

4 討論

穿龍薯蕷具有祛風濕、活血等功效［2］，主治風寒濕痹、勞損扭傷、癰腫等，臨床上主要用于治療冠心病、抗動脈粥樣硬化、降血脂、平喘抗炎、抗腫瘤等［3-8］。而薯蕷皂苷是從穿龍薯蕷中提取出來的一種天然皂苷類化合物，主要成分為水糖性總皂苷，本研究觀察其對RA模型大鼠的研究。

RA是一種以關節滑膜慢性炎癥為特征的自身免疫性疾病，主要表現為關節疼痛、腫脹和僵硬，出現關節骨和軟骨破壞，進而導致不可逆的關節畸形［9］。以CFA誘導的大鼠模型與人RA的病理過程類似，其誘導RA大鼠模型廣泛用于研究，組織學特點包括滑膜增生、炎性細胞浸潤、軟骨及骨組織破壞等特征［10］。研究表明，知母總皂苷可明顯改善佐劑型關節炎大鼠改善滑膜增生和炎性浸潤［11］。本研究觀察到CFA誘導大鼠關節炎后，模型組大鼠出現關節紅腫、活動不便，給予薯蕷皂苷后很大程度上緩解大鼠關節腫痛，這與薯蕷皂苷對膠原誘導關節炎模型的作用相近［12-13］，證實了薯蕷皂苷可緩解RA模型大鼠的關節腫痛。但是單用一種動物模型有一定的局限性［14］，應用多種動物模型從不同角度去驗證，今后將進一步完善，同時提取人滑膜細胞進一步完善體外實驗。

目前RA的發病機制尚不清楚，但已證實炎癥反應在RA的病理進程中發揮重要作用。目前已開發出多種針對不同炎癥因子的生物制劑，對RA的治療發揮重要作用，但價格較高［15］。近年來，薯蕷皂苷元免疫調節的作用被逐漸重視［16-18］。穿龍薯蕷總皂苷具有免疫抑制作用。研究表明，穿龍薯蕷皂苷元對RA模型小鼠的Th1和Th17細胞可以產生明顯抑制作用，對Th2細胞、Treg細胞有一定的促進作用［19-20］，對膠原誘導小鼠關節炎模型有一定的療效，可降低血清和關節滑液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，這與本研究結果一致。同時，本實驗RA模型大鼠血清中PGE2和COX-2水平明顯升高。COX-2為前列腺素合成過程的關鍵酶，該酶在正常細胞中的含量較低，在TNF-α、IL-1β等炎癥因子作用下，其表達會明顯升高，PGE2水平也隨之增高。COX-2及PGE2已成炎癥性疾病及腫瘤治療的重要的靶分子［21］。本研究結果證實薯蕷皂苷可降低兩者水平，明確其對CFA誘導的大鼠模型具有抗炎效應。

本研究發現，RA模型組大鼠滑膜組織中可見大量中性粒細胞浸潤；薯蕷皂苷干預后，中性粒細胞浸潤減少。提示薯蕷皂苷可能通過影響氧化應激發揮治療作用。目前認為，RA發病進程中的重要促炎因子IL-1β、TNF-α可通過NADPH氧化酶產生活性氧簇［22］。RA患者的滑膜組織及軟骨是一氧化氮的主要來源之一。活性氧簇和活性氮簇相互作用可產生大量活性產物，進而參與RA疾病［23］。目前尚無薯蕷皂苷與氧化應激的研究，我們課題組也將進一步完善研究。

中醫藥在治療類風濕關節炎的臨床實踐中積累了豐富的經驗［24-25］，具有良好的應用和開發前景。多成分、多靶點、多途徑是中藥治療疾病的特點［26-27］。RA患者的腫瘤發生率、心血管疾病發生率較高，薯蕷皂苷除了明顯的免疫調控作用外，同時具有抗腫瘤、降血脂作用，對RA患者的綜合治療很有優勢。通過本研究明確薯蕷皂苷對RA的治療作用，為推進薯蕷皂苷臨床研究提供更全面的理論依據。