牛膝多糖調控Wnt/β-catenin通路改善骨質疏松性骨折大鼠骨代謝的研究*

楊豪，曾范慧

駐馬店市中心醫院，河南 駐馬店 463400

骨質疏松是由于骨量低、骨微結構遭破壞而引發的全身性骨骼疾病。老年人群較為常見，絕經后的女性發病率也較高［1］。隨著老齡化日益加重，骨質疏松患者發病率也逐年上升［2］。有文獻報道，僅骨質疏松所致髖部骨折患者中1年內因并發癥致死率約20%，50%左右患者致殘，嚴重影響患者的生活［3］。目前增強骨質的常見藥物有雌激素、降鈣素、生長激素等，但是長期使用藥物引起的不良反應不容忽視［4］。牛膝具有補肝腎、強筋骨、活血化瘀的功效［5］。牛膝多糖為牛膝的主要成分之一。研究表明，牛膝多糖可促進關節軟骨細胞增殖，可應用于骨性關節炎［6］。Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）通路在骨發育、分化及修復等過程中具有重要調節作用。研究發現，激活Wnt/β-catenin通路可以調節骨代謝，促進骨折愈合［7］。本研究基于Wnt/βcatenin通路探討牛膝多糖對骨質疏松骨折大鼠骨代謝的調控作用，為臨床治療骨質疏松骨折提供依據。

1 材料

1.1 動物清潔級SD雌鼠60只，體質量270～290 g，購自上海吉輝實驗動物飼養有限公司，許可證號：SCXK（滬）2019-0001。飼養條件：12 h光照12 h黑暗，溫度（25±2）℃，相對濕度40%～60%，自由飲食和進水。倫理批號：ZMDCH201902-03。

1.2 藥物與試劑牛膝多糖（純度≥98%，蘭州沃特萊斯生物科技有限公司，批號：130415）；尼爾雌醇（安徽圣鷹藥業有限公司，批號：190412）。生理鹽水（遼寧民康制藥有限公司，批號：20181204）；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒（北京全式金生物技術有限公司，批號：180316、180520）；細胞裂解液（上海李記生物科技有限公司，批號：20180416003）；制膠試劑盒（北京德元國際科技有限公司，批號：20180912A）；電化學發光（electrochemi luminescence，ECL）試劑盒（上海炎熙生物科技有限公司，批號：181114C）；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）預混體系（SYBR GreenⅠ）（上海聯邁生物工程有限公司，貨號：RT0416135208）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素（bone gla protein，BGP）、Ⅰ型前膠原氨基端前肽（type Iprocollagen propeptide，PINP）、Ⅰ型膠原蛋白交聯N端端肽（N-terminal typeⅠcollagen telopeptide，NTx）酶聯免疫（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司，批號：190106、190225、190218、190316）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatage，TRAP）ELISA試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號：20181013007）；蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：1805A）；引物合成委托蘇州金唯智生物科技有限公司；β-catenin、RUNT相關轉錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨形成轉錄因子（Osterix）、磷酸化β-連環蛋白（phosphorylationβ-catenin，p-β-catenin）、β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）二 抗（美 國Abcam公 司，批 號：180611、180425、180326、180107、180922、180715）；蛋白定量試劑盒（美國Sigma公司，批號：1904112）。

1.3 儀器HBS-1096A型酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）；HHQ-3558型組織切片機（杭州艾普儀器設備有限公司）；BK-T型攤烤片機（山東博科生物產業有限公司）；BX53M型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；Mini-PROTEAN Tetra型電泳槽和Trans-Blot Turbo型蛋白轉印系統（美國Bio-Rad公司）；AriaDNA型RT-qPCR儀（加拿大魯美科思公司）；UltraFocus型雙能X射線小動物骨密度儀（美國Faxitron公司）。

2 方法

2.1 動物模型的復制與給藥從60只大鼠中隨機挑出50只進行去卵巢骨質疏松大鼠模型的制備，打開大鼠腹腔，切除大鼠兩側卵巢并縫合傷口，余下10只僅開腹腔、切除卵巢周圍的脂肪組織，不進行卵巢切除并縫合傷口，記作假手術組。正常飼養10周后，使用雙能X射線骨密度儀檢測60只大鼠骨密度值，當建模大鼠骨密度值低于假手術組大鼠骨密度值平均數2.5個標準差以上為建模成功。然后將大鼠右側股骨中段切開骨膜，橫向鋸斷股骨，立即使用克氏針將斷骨固定后進行傷口縫合。將建模成功的大鼠隨機分為5組，分別為模型組、陽性對照組及牛膝多糖高、中、低劑量組。建模術后第2天大鼠進行藥物治療，陽性對照組大鼠灌胃0.21 mg·kg-1尼爾雌醇，牛膝多糖高、中、低劑量組分別灌胃8 g·kg-1、4 g·kg-1、2 g·kg-1牛膝多糖，假手術組和模型組分別灌胃同體積生理鹽水，每天1次，連續12周。

2.2 檢測大鼠骨密度（bone m ineral density，BMD）水平 分別于給藥前和給藥12周后通過雙能X線吸收測量法檢測大鼠股骨BMD水平，將雙能X線骨密度儀設置為Hi-red Small animal模式，檢測大鼠股骨BMD水平。

2.3 檢測大鼠骨代謝指標給藥12周后，對大鼠進行尾靜脈取血，收集血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清ALP、BGP、PINP、NTx、TRAP水平。

2.4 骨組織病理學檢查每組隨機選擇3只大鼠，脫頸椎法處死后，取大鼠骨折端骨組織，經過甲醛固定過夜后加入10%EDTA溶液中脫鈣4周。經過包埋、切片后使用HE染色試劑盒進行染色，操作參考產品說明書。經過中性樹脂封片后，在光學顯微鏡下觀察骨組織骨小梁的數量、排列情況、形態及連續性等。

2.5 檢測骨質疏松性骨折模型大鼠骨折端骨組織中β-catenin mRNA、Runx2 mRNA、Osterix mRNA水平每組隨機選擇3只大鼠，頸椎脫臼處死后，取大鼠骨折端骨組織，加入液氮進行研磨，用RNA提取試劑盒提取組織中總RNA，使用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA。查找目的基因mRNA序列，設計出上下游引物。β-catenin上游引物：5′-TAGTACCGATAGCTAAACTG-3′，下游引物：5′-TAAGTACCTCAATACGTAGA-3′，產物長度為121 bp；Runx2上游引物為：5′-TGACTTACGTCCAGTCAACG-3′，下 游 引 物 為：5′-TGGTACCTAGCTGGTAATAC-3′，產物長度為123 bp；Osterix上游引物：5′-TAACGTGCATCGGCTAACGT-3′，下游引物：5′-GATCCGTGCGGTACCATACT-3′，產物長度為119 bp；β-actin上游引物：5′-TGCACTTGCATGACTCGAAT-3′，下游引物：5′-GATTACCATCGGATCGGATA-3′，產物長度132 bp。按照cDNA 0.5μL，上下游引物各1μL，熒光預混試劑1μL，dNTP 1μL，ddH2O 5.5μL，總體積10μL的體系加入PCR的96孔板中。退火溫度設置為58℃，40個循環。反應結束后，使用配套熒光采集系統得到各樣品Ct值，以β-actin為持家基因，根據2-ΔΔCt得出目的基因水平。

2.6 W estem Blot法檢測骨質疏松性骨折模型大鼠骨折端骨組織中β-catenin、Runx2、Osterixl及p-β-catenin蛋白表達每組隨機選擇3只大鼠，頸椎脫臼處死后，取大鼠骨折端骨組織，將骨折端骨組織中加入少許液氮，研磨勻漿后，加入細胞裂解液，在4℃搖床中過夜裂解后，10 000×g離心5 min，上清即為細胞總蛋白。用細胞核蛋白提取試劑盒提取細胞核蛋白；加入上樣緩沖液并在沸水中煮沸5 min使蛋白變性；用制膠試劑盒制膠并上樣進行電泳，電泳結束后轉膜，使用5%脫脂牛奶封閉，一抗孵育過夜，更換二抗室溫孵育2 h，在暗室中使用ECL發光液顯色，經過顯影液、定影液處理后，在膠片上顯示出目的條帶。用掃描儀將膠片上的條帶進行灰度值分析，以β-actin為參考，計算目的蛋白相對表達水平。

2.7 統計學方法采用SPSS 20.0軟件對實驗數據進行統計學分析，實驗數據均采用平均數±標準差（±s）表示，多組間比較使用單因素方差分析，兩組間比較使用SNK-q檢驗。P＜0.05認為具有統計學意義。

3 結果

3.1 對骨質疏松性骨折模型大鼠股骨BMD水平的影響50只建模大鼠，共48只建模成功。模型組和陽性對照組每組9只，牛膝多糖高、中、低劑量組每組10只。大鼠治療期間，由于灌胃操作不當導致牛膝多糖高劑量組和中劑量組分別死亡1只。股骨BMD水平檢測結果顯示：治療前，與假手術組比較，模型組、陽性對照組和牛膝多糖高、中、低劑量組大鼠BMD水平均顯著降低（P＜0.05），各組間差異無統計學意義（P＞0.05）。治療后，與假手術組比較，模型組大鼠BMD水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，牛膝多糖高、中、低劑量組與陽性對照組大鼠BMD水平顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表1 對骨質疏松性骨折模型大鼠股骨BMD水平的影響 （±s）

表1 對骨質疏松性骨折模型大鼠股骨BMD水平的影響 （±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 n治療前/mg·cm-2 治療后/mg·cm-2 10 268.44±21.24 269.09±20.05模型組 9 209.71±20.09* 197.26±15.36*陽性對照組 9 210.39±19.14* 243.47±12.01＃牛膝多糖高劑量組 9 214.33±33.54* 258.66±10.52＃牛膝多糖中劑量組 9 207.54±20.48* 242.21±19.33＃牛膝多糖低劑量組 10 209.64±26.98* 227.99±11.15假手術組＃

3.2 大鼠血清骨代謝指標與假手術組比較，模型組大鼠血清ALP、BGP和PINP水平顯著降低（P＜0.05），NTx、TRAP水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，牛膝多糖高、中、低劑量組與陽性對照組大鼠血清ALP、BGP和PINP水平顯著升高（P＜0.05），NTx、TRAP水平顯著降低（P＜0.05）。見表2。

表2 大鼠血清骨代謝指標 （±s）

表2 大鼠血清骨代謝指標 （±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 n ALP/U·L-1 BGP（ρ/μg·L-1） PINP（ρ/μg·L-1）NTx（c/μmol·L-1）TRAP（ρ/μg·L-1）1.65 1.48.±0.34模型組 9 112.33±11.45* 0.91±0.13* 26.44±5.85* 19.35±4.87* 2.85±0.56*陽性對照組 10 156.70±15.05＃ 1.45±0.25＃ 62.81±7.12＃ 13.12±3.06＃ 2.28±0.16＃牛膝多糖高劑量組9 188.45±13.21＃ 1.71±0.18＃ 84.33±10.86＃ 10.01±1.82＃ 1.77±0.39＃牛膝多糖中劑量組9 155.38±18.33＃ 1.42±0.18＃ 65.50±7.01＃ 13.54±1.08＃ 2.21±0.25＃牛膝多糖低劑量組10 125.44±12.08＃ 1.19±0.12＃ 51.27±6.24＃ 16.99±1.39＃ 2.56±0.17假手術組 10 200.89±22.06 2.05±0.21 93.45±12.98 8.28±＃

3.3 大鼠骨折端骨組織病理學變化假手術組大鼠骨小梁粗大致密，粗細均勻且結構連續性好；模型組大鼠骨小梁數量減少，排列凌亂且稀疏，骨小梁連接性差，存在大片無骨小梁骨髓區；陽性對照組大鼠骨小梁連續性較好；牛膝多糖高、中、低劑量組隨著劑量的增加，骨小梁逐漸數量增多，形態增粗，連續性增加。見圖1。

圖1 大鼠骨折端骨組織病理學觀察（HE染色，×100）

3.4 對骨質疏松性骨折模型大鼠骨折端骨組織中β-catenin m RNA、Runx2 m RNA、Osterix m RNA水平的影響與假手術組比較，模型組大鼠骨折端骨組織β-catenin mRNA、Runx2 mRNA、Osterix mRNA水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，牛膝多糖高、中、低劑量組與陽性對照組大鼠骨折端骨組織β-catenin mRNA、Runx2 mRNA、Osterix mRNA水平顯著升高（P＜0.05）。見表3。

表3 RT-qPCR檢測骨折端骨組織中β-catenin m RNA、Runx2 m RNA、Osterix m RNA表達 （±s）

表3 RT-qPCR檢測骨折端骨組織中β-catenin m RNA、Runx2 m RNA、Osterix m RNA表達 （±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 n β-catenin mRNA Runx2 mRNA Osterix mRNA假手術組0.88±0.21 1.25±0.45 0.74±0.21模型組 3 0.32±0.09* 0.47±0.06* 0.11±0.02*對照組 3 0.45±0.06＃ 0.72±0.12＃ 0.46±0.06＃牛膝多糖高劑量組 3 0.67±0.13＃ 0.95±0.17＃ 0.63±0.12＃牛膝多糖中劑量組 3 0.45±0.05＃ 0.76±0.12＃ 0.45±0.08＃牛膝多糖低劑量組 3 0.39±0.03＃ 0.58±0.08＃ 0.33±0.04 3＃

3.5 對骨質疏松性骨折模型大鼠骨折端骨組織中β-catenin、胞核β-catenin、Runx2、Osterixl蛋白及p-β-catenin表達的影響與假手術組比較，模型組大鼠骨折端骨組織β-catenin、胞核β-catenin、Runx2、Osterixl蛋白表達顯著下調（P＜0.05），p-β-catenin/β-catenin水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，牛膝多糖高、中、低劑量組與陽性對照組大鼠骨折端骨組織β-catenin、胞核βcatenin、Runx2、Osterixl蛋白表達顯著上調（P＜0.05），p-β-catenin/β-catenin水平顯著降低（P＜0.05）。見圖2、表4。

表4 骨折端骨組織中β-catenin、胞核β-catenin、Runx2、Osterixl蛋白及p-β-catenin表達檢測 （±s）

表4 骨折端骨組織中β-catenin、胞核β-catenin、Runx2、Osterixl蛋白及p-β-catenin表達檢測 （±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

-actin假手術組 3 0.88±0.11 0.62±0.12 0.30±0.07 1.19±0.21 0.組別 n β-catenin/β-actin胞核β-catenin/β-actin p-β-catenin/β-catenin Runx2/β-actin Osterix/β 71±0.12模型組 3 0.34±0.07* 0.15±0.02* 1.05±0.18* 0.45±0.06* 0.21±0.04*陽性對照組 3 0.69±0.10＃ 0.35±0.06＃ 0.69±0.12＃ 0.73±0.12＃ 0.47±0.06＃牛膝多糖高劑量組 3 1.06±0.18＃ 0.79±0.13＃ 0.42±0.08＃ 0.94±0.16＃ 0.65±0.12＃牛膝多糖中劑量組 3 0.75±0.15＃ 0.36±0.07＃ 0.55±0.03＃ 0.77±0.08＃ 0.44±0.05＃牛膝多糖低劑量組 3 0.58±0.11＃ 0.23±0.03＃ 0.81±0.11＃ 0.58±0.08＃ 0.35±0.05＃

圖2 骨折端骨組織中β-catenin、胞核β-catenin、Runx2、Osterixl蛋白及p-β-catenin表達檢測

4 討論

由于女性絕經后卵巢功能減退導致骨代謝紊亂、破骨細胞活性增強，使骨小梁吸收加快，成骨細胞活性相對減弱，骨形成速度緩慢，最終導致骨丟失，發生骨質疏松［8-9］。骨質疏松表現為骨量減少、骨微結構破壞、骨脆性增加，增加了骨折的風險。骨質疏松性骨折常見脊柱骨折、尺橈骨骨折、髖部骨折等，嚴重降低患者的生活質量［10］。尼爾雌醇是雌激素類藥物，也是絕經期婦女防治骨質疏松的常用藥物，具有吸收好、效果明顯的特點［11］。但有研究表明，長期使用雌激素類藥物可能會引起頭痛、高血壓、子宮出血，增加患卵巢癌、子宮肌瘤的風險等不良反應［12］。本研究通過摘除大鼠雙側卵巢后，經雙能X線骨密度儀檢測BMD水平均降低，骨質疏松大鼠經過右側股骨骨折后，骨質疏松骨折大鼠模型制備成功。

本研究中牛膝多糖高、中、低劑量組和陽性對照組大鼠經過12周的治療后，BMD水平顯著提高，骨代謝發生改善，提示常規西藥和牛膝多糖均能增強骨質疏松癥大鼠的骨密度。本研究還發現，經過牛膝多糖治療后，大鼠血清NTx和TRAP水平較模型組均降低，表明牛膝多糖具有抑制骨吸收的作用。ALP在成骨過程中能水解磷酸酯和焦磷酸鹽活性，有利于骨礦化，促進骨形成［13-14］。血清中ALP水平可能來自骨組織及肝臟等其他組織。因此，檢測機體骨形成水平還需更具特異性的骨形成指標如BGP來驗證。BGP主要由成骨細胞合成，可與骨基質結合，維持骨正常礦化速度，血清中BGP水平的高低可反映成骨細胞活性［15-16］。人體骨基質中約90%的成分為Ⅰ型膠質，PINP是Ⅰ型膠原前體轉化為膠原纖維質的過程中裂解的產物之一。當一個膠原分子合成，會產生一個PINP分子，因此，PINP直接反映出Ⅰ型膠原合成速率［17］。本研究結果顯示，牛膝多糖組大鼠血清中ALP、BGP和PINP水平均較模型組升高，表明牛膝多糖可促進骨形成。骨質吸收過程中，NTx是骨膠原纖維降解產物。因此，血清中NTx反映了骨吸收水平，是骨吸收的特異性指標［14］。TRAP主要由破骨細胞釋放，對骨基質中礦化底物進行降解，反映了破骨細胞活性［15］。牛膝歸肝、腎經，有補肝腎、健筋骨、活血化瘀的功效，可用于治療肝腎虧虛、跌打瘀痛、腰膝酸痛、筋骨無力等［18-19］。牛膝多糖是牛膝的活性成分之一，可用于治療骨性關節炎［20］。李開言等［21］研究表明，牛膝多糖含藥血清應用于損傷的軟骨細胞可提高其增殖活性，對改善骨代謝、防治骨質疏松癥具有重要意義，與本研究結果相符。

Wnt/β-catenin信號通路不僅在胚胎發育過程中發揮重要調節作用，在骨代謝過程中也十分關鍵［22-23］。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵分子，無Wnt信號激活時，β-catenin會被Axin/APC/GSK 3β復合體磷酸化并被溶酶體降解，當Wnt信號被激活時，β-catenin不發生磷酸化，可進入細胞核激活其下游信號因子Runx2［24］。Runx2是Runt家族成員之一，是成骨分化的特異性轉錄因子。研究表明，Runx2基因缺失可導致成骨細胞分化被抑制，骨膜成骨和軟骨內成骨會被抑制［25］。此外，Runx2可促進Ⅰ型膠原合成，提高ALP、BGP、PINP水平，抑制NTx和TRAP水平［26］。Osterix是Runx2下游信號因子，也是骨發育過程中主要調節因子之一。研究表明，Osterix基因敲除小鼠，Runx2表達正常，敲除小鼠Osterix基因無法正常表達，且成骨細胞無法發育為成骨細胞［27］。因此，Osterix與Runx2在成骨細胞增殖分化和骨代謝過程中發揮重要作用。本研究中經過牛膝多糖治療后β-catenin、胞核β-catenin、Runx2和Osteri蛋白表達增加而p-β-catenin水平下降。郎小琴等［28］對老年骨質疏松大鼠模型灌胃牛膝多糖發現，骨形成指標水平均升高，而骨吸收指標水平降低，與本研究結果一致；此外，還發現大鼠雙側最大應力及斷裂吸收能量顯著升高，證實牛膝多糖不僅可改善老年骨質疏松大鼠的骨代謝水平，還可降低骨折風險。Li R等［29］研究顯示，微小核糖核酸-23b-3p可阻斷Wnt/β-catenin信號通路參與絕經后骨質疏松，且發現p-β-catenin表達升高，而該通路下游的Runx2和Osterix表達下降。由此推測，牛膝多糖可提高大鼠骨密度，改善骨代謝水平可能與激活Wnt/β-catenin信號通路有關。

綜上所述，牛膝多糖可提高骨質疏松骨折模型大鼠骨密度，改善大鼠骨代謝水平，減輕大鼠骨組織病理損傷，可能與激活Wnt/β-catenin信號通路，上調β-catenin、胞核β-catenin表達，下調p-β-catenin表達，從而促進下游Runx2和Osterix表達有關。本研究為骨質疏松骨折患者治療提供新思路。由于參與骨形成信號通路較多，是否影響其他信號通路尚未涉及，需進行進一步研究。