雙藤湯醇提取物治療去勢骨質疏松癥大鼠的實驗研究*

魏根紅，王上曾，田明波，郭國興，郭小偉

1.平頂山市中醫醫院，河南 平頂山 467000；2.河南省中醫院，河南 鄭州 450002；3.鄭州市人民醫院，河南 鄭州 450015；4.鄭州市骨科醫院，河南 鄭州 450052

骨質疏松癥是一種以骨量減少，骨微結構破壞，骨密度降低等為特征的慢性骨骼疾病，在絕經后女性中多見［1］。據統計，我國60歲以上老年人骨質疏松癥患病率高達30%～50%，其中60～70歲絕經后女性的患病率高達50%～70%［2］。臨床治療骨質疏松的藥物主要有雌激素類藥物、雙膦酸鹽、鈣劑等，其中雌激素替代療法目前在臨床最常見，雖然該方法具有一定療效，但會增加乳腺癌、心腦血管疾病等的發病風險［3］。因此，尋找副作用低，療效穩定的替代藥物尤為重要。雙藤湯由雷公藤和黑骨藤組成，雷公藤是衛矛科植物，具有祛風除濕、消腫止痛的功效，可改善骨微結構，促進骨折愈合［4］。黑骨藤是蘿藦科植物，具有活血消癰、祛風除濕的功效，可抑制破骨細胞分化，抑制骨吸收［5］。二者均能改善骨質疏松癥的相關臨床癥狀，但雙藤湯能否治療骨質疏松癥尚未見文獻報道，因此，本研究建立去勢骨質疏松大鼠模型，探討雙藤湯醇提取物對其的療效及相關作用機制，為雙藤湯在骨質疏松癥臨床治療中的應用提供理論依據。

1 材料

1.1 動物60只3月齡SPF級SD雌鼠，體質量260～280 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0001。飼養條件：溫度18～26℃，相對濕度40%～60%，12 h/12 h晝夜循環，自由飲食、飲水。

1.2 藥物與試劑雷公藤木質部、黑骨藤（亳州仁益中藥材銷售有限公司，批號：190613、190528）；阿侖膦酸鈉片（美國默沙東公司，規格：70 mg/片，批號：20190215A）；青霉素［華北制藥股份有限公司，規格：0.48 g（80萬U），批號：201904］。多聚甲醛、硝酸溶液（唐山中浩化工有限公司，貨號：135876、132691）；細胞裂解液（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：201806）；反轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號：G1023507）；大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）、Ⅰ型膠原交聯C-末端肽（C-terminal telopeptide of typeⅠcollagen，CTX-1）、骨鈣素（bonegla protein，BGP）、I型前膠原N端前肽（type I procollagen propeptide，PINP）ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：R190124、R190610、R190511、R190420）；蘇木素伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：20190415007）；Trizol（美國Invitrogen公司，批號：190412Y）；二喹啉甲酸法（bicin choninic acid，BCA）試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司，批號：20190513）；熒光預混液（美國TaqMan公司，批號：190508C）；骨保護素（osteoprotegerin，OPG）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）兔單克隆抗體及二抗（美國Abcam公司，批號：190216、190328、190410；190425、190427、190521）；β-actin蛋白一抗及二抗（南京博研生物科技有限公司，貨號：P0416112、P0528147）；引物合成委托蘇州金唯智生物科技有限公司。

1.3 儀器UltraFocus型小動物雙能X線骨密度診斷儀（美國Faxitron公司）；TDZ5-BP型醫用離心機（長沙湘銳離心機有限公司）；xMark酶標儀（美國Bio-Rad公司）；9500型實時逆轉錄聚合酶鏈反應（real time-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）儀（美國ABI公司）；LV-150N型光學顯微鏡（日本尼康公司）；DYCZ-30C型蛋白凝膠電泳儀（北京六一儀器廠）；Trans-Blot Turbo全能型蛋白轉印系統（美國Bio-Rad公司）；CA288型全自動凝膠成像分析系統（上海精密儀器儀表有限公司）。

2 方法

2.1 雙藤湯醇提取物制備將15 g雷公藤和9 g黑骨藤混合后粉碎，加入80%乙醇，50℃加熱回流提取，可得雙藤湯醇提取物（1 g醇提取物相當于5 g生藥量）。

2.2 模型建立及分組給藥3月齡的SPF級SD雌鼠60只，隨機分為假手術組、模型組、阿侖膦酸鈉組、雙藤湯醇提取物高劑量組、雙藤湯醇提取物中劑量組、雙藤湯醇提取物低劑量組，每組10只。采用2%戊巴比妥鈉腹腔注射進行麻醉，打開大鼠腹腔，暴露卵巢組織，在卵巢根部結扎并摘除雙側卵巢，假手術組大鼠僅切除卵巢附近脂肪組織，不切除卵巢，手術完成后縫合。術后每只大鼠每天注射1.0×105U的青霉素預防感染，連續3 d。3個月后，采用雙能X線骨密度診斷儀檢測大鼠股骨骨密度，大鼠骨密度值比建模前下降30%以上，認為去勢骨質疏松癥大鼠模型建模成功。建模成功后，雙藤湯醇提取物高、中、低劑量組分別灌胃給予2 mL不同濃度的雙藤湯醇提取物（161 g·L-1、80.5 g·L-1、40.25 g·L-1），阿侖膦酸鈉組灌胃給予2 mL濃度為50 g·L-1的阿侖膦酸鈉溶液，假手術組和模型組均灌胃給予等體積的生理鹽水，每日1次，連續2個月。

2.3 大鼠骨密度檢測采用雙能X線骨密度診斷儀分別于治療前、治療后檢測大鼠左側股骨和脛骨骨密度值。大鼠麻醉后，將待測部位固定在掃描儀探頭下，通過骨密度測定軟件，分析待測部位骨密度值。

2.4 ELISA法檢測大鼠骨代謝水平分別在治療前和治療后，采用ELISA法檢測大鼠血清中TRAP、CTX-1、BGP、PINP的水平。取大鼠尾靜脈血，室溫靜置2 h后，3 000×g離心20min分離血清，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，使用酶標儀檢測各樣本孔光密度（optical density，OD）值，依據標準蛋白濃度與OD值得到回歸方程，并繪制標準曲線，根據樣本孔OD值，計算出對應蛋白濃度。

2.5 股骨形態學觀察通過HE染色觀察大鼠股骨病理變化。取大鼠股骨組織，4%多聚甲醛固定48 h，5%硝酸脫鈣處理1周后進行石蠟包埋。將組織蠟塊切成厚度4μm的組織切片，經過脫蠟復水后，按照HE染色試劑盒說明書對切片進行HE染色，經過中性樹脂封片后，光鏡下觀察大鼠股骨病理變化。

2.6 RT-qPCR檢測大鼠股骨組織中OPG mRNA、RANKL mRNA、NF-κB m RNA的表達水平采用RT-qPCR檢測大鼠股骨組織中OPG mRNA、RANKL mRNA、NF-κB mRNA的相對表達量。取大鼠股骨組織，加入少許液氮研磨成粉末狀，Trizol法提取股骨組織總RNA，依據反轉錄試劑盒說明書操作反轉錄成cDNA。根據美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）基因庫中查詢目的基因mRNA序列設計出上下游引物。引物序列見表1。以β-actin為內參基因，通過配套熒光分析軟件分析樣本Ct值，按照2-△△Ct計算目的基因mRNA相對表達量。

表1 引物序列

2.7 Western Blot檢測大鼠股骨組織中OPG、RANKL、NF-κB蛋白的表達水平采用Western blot檢測大鼠股骨組織中OPG、RANKL、NF-κB蛋白的表達水平。取大鼠股骨組織加入少許液氮研磨，加入細胞裂解液，置于4℃裂解過夜。10 000×g離心10 min，取上清，即為總蛋白。采用BCA試劑盒進行蛋白質定量，沸水中變性5 min。蛋白上樣進行凝膠電泳。經過封閉，一抗（稀釋比例1∶1 000、1∶2 000、1∶1 000）、二抗（稀釋比例均為1∶5 000）雜交后顯色，根據圖像分析系統對目的條帶進行灰度值分析，以β-actin為內參，計算目的蛋白相對表達水平。

2.8 統計學方法使用SPSS 22.0對實驗結果進行統計學分析，實驗數據使用平均值±標準差（±s）表示，多組間比較使用單因素方差分析，兩兩比較使用SNK-q檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 雙藤湯醇提取物對去勢骨質疏松癥大鼠骨密度的影響造模結束后檢測發現，模型組和阿侖膦酸鈉組均有1只造模不成功，后續實驗將其舍棄。治療前，與假手術組比較，造模大鼠股骨和脛骨骨密度顯著下降（P＜0.05）。治療后，與假手術組比較，模型組大鼠股骨和脛骨骨密度均顯著下降（P＜0.05）；與模型組比較，雙藤湯醇提取物高、中、低劑量組大鼠股骨和脛骨骨密度顯著升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見表2。

表2 雙藤湯醇提取物對去勢骨質疏松癥大鼠骨密度的影響 （±s）

表2 雙藤湯醇提取物對去勢骨質疏松癥大鼠骨密度的影響 （±s）

注：與假手術組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與治療前比較，△P＜0.05

-2組別 n 股骨/g·cm-2脛骨/g·cm治療前 治療后假手術組治療前 治療后10 0.29±0.02 0.28±0.02 0.24±0.02 0.23±0.01模型組 9 0.22±0.01a 0.21±0.01a 0.19±0.01a 0.18±0.01a阿侖膦酸鈉組 9 0.21±0.01a 0.25±0.01b△ 0.19±0.01a 0.21±0.01b△雙藤湯醇提取物高劑量組 10 0.21±0.01a 0.26±0.01b△ 0.19±0.01a 0.23±0.02b△雙藤湯醇提取物中劑量組 10 0.22±0.01a 0.25±0.01b△ 0.19±0.01a 0.21±0.01b△雙藤湯醇提取物低劑量組 10 0.21±0.01a 0.23±0.02b△ 0.19±0.02a 0.19±0.01b △

3.2 雙藤湯醇提取物對去勢骨質疏松癥大鼠骨代謝的影響治療前，與假手術組比較，各造模大鼠血清中TRAP、CTX-1的水平顯著升高（P＜0.05），BGP、PINP的水平顯著降低（P＜0.05）。治療后，與假手術組比較，模型組大鼠血清中TRAP、CTX-1的水平顯著升高（P＜0.05），BGP、PINP的水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清TRAP、CTX-1的水平顯著下降（P＜0.05），而BGP、PINP的水平顯著升高（P＜0.05），且雙藤湯醇提物的作用效果呈現明顯的劑量依賴性。見表3。

表3 雙藤湯醇提取物對去勢骨質疏松癥大鼠骨代謝的影響 （±s）

表3 雙藤湯醇提取物對去勢骨質疏松癥大鼠骨代謝的影響 （±s）

注：與假手術組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與治療前比較，△P＜0.05

-1分組 n TRAP/U·L CTX-1（ρ/μg·L-1）BGP（ρ/μg·L-1）PINP（ρ/μg·L-1）治療前 治療后假手術組 10 4.24±0.44 4.36±0.47 113.68±0.35 111.62±7.51 38.91±6.02 38.69±5.65 33.25±4.01治療前 治療后治療前 治療后治療前 治療后35.17±5.25模型組 9 9.33±1.06a 9.41±0.81a 184.68±10.50a 185.74±9.82a 18.12±1.96a 16.52±3.56a 14.33±2.58a 13.89±2.11a阿侖膦酸鈉組 9 9.41±0.69a 6.35±0.29b△ 185.71±9.12a 153.68±7.55b△17.98±3.05a 27.50±4.01b△ 13.92±2.20a 24.50±3.06b△雙藤湯醇提取物高劑量組10 9.35±1.93a 5.28±0.96b△ 187.02±7.65a 130.74±9.48b△18.15±2.89a 20.93±2.09b△ 14.04±1.74a 29.48±4.24b△雙藤湯醇提取物中劑量組10 9.37±1.63a 6.38±1.38b△ 182.90±8.23a 150.01±6.58b△17.66±2.68a 26.81±3.51b△ 13.65±2.66a 23.92±3.29b△雙藤湯醇提取物低劑量組10 9.40±0.90a 8.08±0.75b△ 191.22±9.29a 167.82±5.61b△18.09±1.06a 32.44±2.36b△ 14.23±3.15a 18.36±2.68b△

3.3 雙藤湯醇提取物對去勢骨質疏松癥大鼠股骨組織形態學的影響假手術組大鼠骨小梁分布均勻致密，無明顯變細，結構完整，骨髓腔較小。模型組大鼠骨小梁出現斷裂，連續性差，骨髓腔明顯增大。與模型組比較，雙藤湯醇提取物高、中、低劑量組大鼠股骨組織骨小梁面積增大，結構完整，骨髓腔減小。見圖1。

圖1 雙藤湯醇提取物對去勢骨質疏松癥大鼠股骨組織形態學的影響（HE染色，×400）

3.4 雙藤湯醇提取物對去勢骨質疏松癥大鼠股骨組織中OPG mRNA、RANKL mRNA及NF-κB mRNA表達水平的影響與假手術組比較，模型組大鼠RANKL mRNA、NF-κB mRNA的表達水平顯著升高（P＜0.05），OPG mRNA的表達水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，雙藤湯醇提取物給藥組大鼠RANKL mRNA、NF-κB mRNA的表達水平顯著降低（P＜0.05），OPG mRNA的表達水平顯著升高（P＜0.05），且雙藤湯醇提物的作用效果呈現明顯的劑量依賴性。見表4。

表4 雙藤湯醇提取物對去勢骨質疏松癥大鼠股骨組織中OPG m RNA、RANKL m RNA及NF-κB m RNA表達水平的影響 （±s）

表4 雙藤湯醇提取物對去勢骨質疏松癥大鼠股骨組織中OPG m RNA、RANKL m RNA及NF-κB m RNA表達水平的影響 （±s）

注：與假手術組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05

mRNA假手術組分組 n OPG mRNA RANKL mRNA NF-κB 3 0.68±0.12 0.52±0.06 0.41±0.07模型組 3 0.22±0.06a 1.21±0.15a 0.95±0.12a阿侖膦酸鈉組 3 0.45±0.05b 0.84±0.11b 0.66±0.06b雙藤湯醇提取物高劑量組3 0.59±0.06b 0.69±0.05b 0.53±0.05b雙藤湯醇提取物中劑量組3 0.47±0.08b 0.82±0.09b 0.68±0.05b雙藤湯醇提取物低劑量組3 0.31±0.07b 1.03±0.12b 0.83±0.09 b

3.5 雙藤湯醇提取物對去勢骨質疏松癥大鼠股骨組織中OPG、RANKL及NF-κB蛋白表達水平的影響與假手術組比較，模型組大鼠股骨組織中RANKL、NF-κB蛋白的相對表達量顯著升高（P＜0.05），OPG蛋白的相對表達量顯著下降（P＜0.05）；與模型組比較，雙藤湯醇提取物高、中、低劑量組大鼠股骨組織RANKL、NF-κB蛋白相對表達量顯著下降（P＜0.05），OPG蛋白的相對表達量顯著升高（P＜0.05），且雙藤湯醇提取物的作用效果呈明顯的劑量依賴性。見圖2，表5。

圖2 雙藤湯醇提取物對去勢骨質疏松癥大鼠股骨組織中OPG、RANKL及NF-κB蛋白表達的影響（Western blot檢測）

表5 雙藤湯醇提取物對去勢骨質疏松癥大鼠股骨組織中OPG、RANKL及NF-κB蛋白表達水平的影響 （±s）

表5 雙藤湯醇提取物對去勢骨質疏松癥大鼠股骨組織中OPG、RANKL及NF-κB蛋白表達水平的影響 （±s）

注：與假手術組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05

組別 n OPG RANKL NF-κB 3 0.82±0.12 0.69±0.09 0.39±0.05模型組 3 0.33±0.08a 1.56±0.25a 1.25±0.11a阿侖膦酸鈉組 3 0.59±0.10b 1.05±0.18b 0.72±0.06b雙藤湯醇提取物高劑量組3 0.70±0.04b 0.83±0.09b 0.58±0.06b雙藤湯醇提取物中劑量組3 0.57±0.09b 1.08±0.12b 0.70±0.12b雙藤湯醇提取物低劑量組3 0.45±0.11b 1.32±0.20b 1.03±0.09假手術組b

4 討論

絕經后骨質疏松癥是由于女性卵巢功能低下，雌激素分泌減少，激發了破骨細胞活性，導致機體骨量減少、骨微結構退化、骨脆性增加而引起的，從而使骨折風險增高［6-8］。目前，骨質疏松癥的治療常以補鈣、改善骨代謝、預防骨折為主，阿侖膦酸鈉可抑制破骨過程，保護骨結構，提高骨密度，有效治療骨質疏松并預防骨質疏松性骨折［9-10］。因此，本研究選擇阿侖膦酸鈉作為陽性對照藥物。中藥在骨質疏松癥臨床治療中運用較廣，常見藥物有淫羊藿、骨碎補、地黃等［11-12］。研究表明，雙藤湯對膝骨關節炎具有一定治療效果［13］，但對骨質疏松癥的療效尚未可知。因此，本研究使用雙藤湯治療去勢大鼠骨質疏松癥，并初步探討其作用機制，為臨床治療提供新的參考。

TRAP和CTX-1反映骨吸收水平。TRAP是破骨細胞標志酶，其活性可以衡量骨吸收能力［14-15］。CTX-1是反Ⅰ型膠原蛋白的代謝產物，是骨吸收水平的另一特異性指標。研究表明，在骨質疏松患者血清中可檢測出TRAP和CTX-1水平異常升高［16］。本研究顯示，骨質疏松模型大鼠TRAP和CTX-1水平顯著升高，而雙藤湯醇提取物治療后，TRAP和CTX-1的水平顯著降低，提示雙藤湯具有抑制骨吸收的作用。BGP、PINP反映骨形成指標［17］，其中BGP是成熟成骨細胞中分泌的鈣結合肽，血清中BGP水平可以反映成骨細胞活性［18］。Ⅰ型膠原主要在骨組織中合成，首先合成原膠原，在I型原膠原的氨基N端和C端各有1個延長肽，其中N端的延長肽即被稱為PINP，當I型原膠原被成骨細胞分泌至細胞外，PINP被蛋白酶切割，進入血液循環［19-20］，因此，PINP可準確反映成骨細胞的活性。本研究顯示，去勢骨質疏松癥大鼠血清中BGP、PINP的水平均顯著降低，而經雙藤湯醇提取物治療后，BGP、PINP的水平顯著升高，表明雙藤湯醇提取物可促進骨形成。此外，本研究檢測大鼠骨密度發現，經雙藤湯醇提取物治療后，骨質疏松癥大鼠骨密度顯著增加，且骨病理形態明顯改善，表明雙藤湯醇提取物對去勢骨質疏松大鼠有治療效果。

OPG是RANKL的誘餌受體，主要由骨髓基質細胞、成骨細胞等分泌，可與RANK競爭性結合RANKL，從而誘導破骨細胞凋亡，抑制骨吸收［21-22］。研究表明，OPG基因敲除小鼠骨吸收能力增強，出現嚴重骨質疏松癥［23］。而RANKL基因過表達小鼠會出現骨密度降低，骨脆性增大［24］。此外，RANKL表達水平還可影響骨代謝［25］，RANKL表達水平升高可引起TRAP和CTX-1水平升高，BGP、PINP水平下降［26］。NF-κB是OPG下游靶基因，當OPG表達下降、RANKL表達升高時，NF-κB被激活，進而參與骨破壞，在骨質疏松癥發生和發展過程中均有重要作用［27］。研究表明，在骨質疏松動物模型中可檢測出NF-κB異?；罨?，而NF-κB基因敲除大鼠則表現出破骨細胞減少，引起骨硬化［28］。本研究顯示，經過雙藤湯醇提取物治療后，大鼠股骨組織中OPG水平升高，RANKL、NF-κB水平降低，推測雙藤湯醇提取物通過上調OPG表達，抑制RANKL、NF-κB表達治療去勢骨質疏松癥大鼠。

綜上所述，雙藤湯醇提取物可提高去勢骨質疏松癥大鼠的骨密度，改善骨代謝水平和骨組織病變，其機制可能與上調OPG表達，抑制RANKL、NF-κB表達有關。本研究僅通過動物實驗驗證雙藤湯醇提取物對骨質疏松大鼠的治療效果，但雙藤湯醇提取物在臨床治療骨質疏松的療效及可行性尚未討論，仍需進一步研究。