山慈菇對肝癌細胞凋亡和上皮間質轉化的影響*

程清波，楊艷萍，王瀅，程文濤，張晉芬，張小莉

1.應城市人民醫院，湖北 應城 432400；2.武漢科技大學附屬醫院，湖北 武漢 430000

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤疾病，在我國的死亡率高居惡性腫瘤第二位，而每年新發病例數量占全球50%以上，且發病率呈逐年上升趨勢，已成為我國重大公共健康問題［1-2］。隨著醫療技術的發展，手術、放化療、靶點治療等手段不斷提高，肝癌得到一定程度的控制，但總體療效仍不理想［3］。近年來，中醫藥在腫瘤治療中的應用受到越來越多的重視。中醫認為，腫瘤屬于“積聚”的范疇，《難經》中記載：“肝之積為肥氣，在左脅下，如覆杯”［4］，其中肝積、肥氣等描述與肝癌相似。山慈菇是蘭科植物杜鵑蘭和獨蒜蘭的假球莖，具有清熱解毒、消癰散結之功效［5-6］。研究顯示，山慈菇在乳腺癌、肝癌、胃癌等癌癥中表現出抗腫瘤作用，可明顯抑制新生毛細血管的生成［7-9］。現今山慈菇與肝癌的研究大多集中于杜鵑蘭的單體成分，而有關含藥血清的藥理研究較少。基于此，本研究考察山慈菇含藥血清（Pseudobulbus Cremastrae seu Pleiones pharmaceutic serum，PCPS）對肝癌細胞HepG2生長運動、凋亡及間質轉化的影響，為山慈菇對肝癌的臨床治療提供實驗基礎。

1 材料

1.1 實驗細胞與動物動物：40只健康SD大鼠，雌性，2月齡，體質量180～220 g，購自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，許可證號：SYXK（京）2019-0030。大鼠正常攝食飲水，12 h/12 h晝夜交替，室內溫度22～25℃，濕度40～60%。

細胞：人肝癌細胞HepG2（上海恒斐生物科技有限公司，貨號：SCC-110211）。

1.2 藥物與試劑山慈菇購自億弘堂藥業有限公司。Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒（弗元生物科技有限公司，貨號：FY600016-20T）；二甲基亞砜（上海聯碩生物科技有限公司，貨號：0231）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK8）、EdU細胞增殖檢測試劑盒（上海碧云天生物，貨號：C0071S、C0038）；細胞固定液、甘氨酸（浙江聯碩生物科技有限公司，貨號：E703-1L、0167）；戊巴比妥鈉、滲透劑（化源網，貨號：57-33-0、1639-66-3）；上皮鈣黏素（E-cadherin）抗體、波形蛋白（Vimentin）抗體、p27抗體、Survivin抗體、神經鈣黏素（N-cadherin）抗體和GAPDH抗體（圣克魯斯生物技術公司，貨號：sc-21791、sc-373717、sc-1641、sc-17779、sc-8424、sc-51332）；HRP標記的山羊抗兔二抗（武漢艾美捷科技有限公司，貨號：4030-05）；DMEM高糖培養基（Worldrm生物商城，貨號：D6046）；RPMI-1640培養基、胎牛血清（鄭州九龍生物制品有限公司，貨號：BC-B-021、JLAQ-110）；RIPA裂解液（上海雅酶生物醫藥科技有限公司，貨號：PC101）；蛋白定量試劑盒、結晶紫指示劑、碘化丙啶（propidium iodide，PI）（上海源葉生物公司，貨號：R21252-500T、R22103、25535-16-4）；75%乙醇（南京化學試劑股份有限公司，貨號：64-17-5）。

1.3 儀器Transwell小室（北京明陽科華生物科技有限公司，貨號：BD-353502）；人工基底膜（北京盈豐大通科技有限公司，貨號：354234）；Being BPN-RHP型CO2培養箱（武漢集思儀器設備有限公司）；MA-6000型熒光定量PCR儀（濟南千司生物技術有限公司）；FrontierTM5000型離心機（美國奧豪斯公司）；BDF-25V270型低溫冰箱（山東博科科學儀器有限公司）；BXF-80型倒置顯微鏡（上海炳宇光學儀器有限公司）；EPS-300型電泳儀（上海巴玖實業有限公司）；JS-680D型凝膠成像儀（杭州得聚儀器設備公司）；1703940型半干電轉膜儀（美國伯樂公司）；CytoFLEX型流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）；XSP-63B型熒光顯微鏡（上海光學儀器公司）；DNM-9606型酶標儀（南京普朗醫用設備有限公司）；ZHBF-RE型旋轉蒸發儀（北京中環北方環保科技有限公司）。

2 方法

2.1 山慈菇濃煎液的制備準確稱取100 g山慈菇，將其粉碎后，置于去離子水中浸泡2 h，通過水煎法制備山慈菇提取液，用旋轉蒸發儀將提取液濃縮至濃度為1 kg·L-1，即為山慈茹濃煎液［10］。

2.2 PCPS的制備將40只雌性SD大鼠隨機分為空白組和山慈菇低、中、高劑量組，每組10只，山慈菇低、中、高劑量組分別以5 mL·kg-1、10mL·kg-1、20mL·kg-1的劑量灌胃給予1 kg·L-1山慈菇濃煎劑，每天1次，連續6 d，空白組給予生理鹽水。末次給藥2 h后，以1 mL·kg-1的劑量腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈采血，靜置2 h，2 000 r·min-1離心15 min，離心半徑20 cm，分離上層血清，置于56℃水浴30 min，過濾除菌，置于-20℃備用［11］。

2.3 細胞培養肝癌細胞HepG2為貼壁細胞，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基重懸細胞，當細胞生長至80%時，進行消化傳代培養，選取對數生長期的細胞用于實驗檢測。

2.4 細胞形態觀察將HepG2細胞以1×106mL-1接種于6孔板，待細胞貼壁后分別添加空白組、山慈菇低劑量組、山慈菇中劑量組、山慈菇高劑量組大鼠的含藥血清，培養24 h，光鏡下觀察細胞的形態學變化。

2.5 CCK8法檢測HepG2細胞活力將HepG2細胞以1×105mL-1接種于96孔板，待細胞貼壁后分別添加空白組、山慈菇低劑量組、山慈菇中劑量組、山慈菇高劑量組大鼠的含藥血清，培養24 h、48 h、72 h及96 h后，加入含有10μL CCK8的培養基，繼續培養1～4 h（待培養基顏色變為橙色），于450 nm波長下檢測各孔吸光度。

2.6 EdU染色檢測HepG2細胞增殖將HepG2細胞以1×106mL-1接種于6孔板，待細胞貼壁后分別添加空白組、山慈菇低劑量組、山慈菇中劑量組、山慈菇高劑量組大鼠的含藥血清，培養24 h，再加入50μmol·L-1EdU培養基100μL，繼續培養2 h，分別加入細胞固定液、甘氨酸、滲透劑進行細胞固化，Apollo染色和DNA染色后，于熒光顯微鏡下觀察并計數粉色熒光細胞（即為增殖細胞）。

2.7 流式細胞儀檢測HepG2細胞凋亡將HepG2細胞以5×104mL-1接種于25 cm2培養瓶中，待細胞貼壁后分別添加空白組、山慈菇低劑量組、山慈菇中劑量組、山慈菇高劑量組大鼠的含藥血清，培養48 h，收集細胞，加入預冷的75%乙醇，4℃固定過夜，再分別加入Annexin V-FITC和PI，避光孵育20 min，加入結合緩沖液，1 h內上流式細胞儀進行檢測。

2.8 Transwell小室實驗檢測HepG2細胞侵襲以Matrigel基質膠包被Transwell小室底膜的上室面，置于六孔板，將HepG2細胞以1×106mL-1接種于Transwell小室上室，下室添加含有20%胎牛血清的培養基，待細胞貼壁后分別添加空白組、山慈菇低劑量組、山慈菇中劑量組、山慈菇高劑量組大鼠的含藥血清，培養24h，拭去基質膠和上室內細胞，75%預冷酒精固定30 min后，以0.1%結晶紫染色5～10 min，光鏡下拍照并計數。

2.9 蛋白免疫印跡法檢測相關蛋白的表達將HepG2細胞以1×106mL-1接種于6孔板，待細胞貼壁后分別添加空白組、山慈菇低劑量組、山慈菇中劑量組、山慈菇高劑量組大鼠的含藥血清，培養24 h后，添加RIPA裂解液提取總蛋白，采用蛋白免疫印跡法檢測各組細胞中細胞周期抑制因子p27、凋亡抑制因子Survivin及上皮間質轉化標記物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表達，以GAPDH為內參，計算各目的蛋白的相對表達量。

2.10 統計學方法采取統計學軟件SPSS 17.0分析處理，數據以平均值±標準差（±s）表示，本文所有實驗進行3次平行實驗，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 PCPS對HepG2細胞形態的影響光鏡下觀察顯示，空白組細胞為橢圓形或短梭形，有短偽足；PCPS處理后細胞偽足減少，且20 mL·kg-1PCPS組細胞體積明顯增大。見圖1。

圖1 PCPS對HepG2細胞形態的影響（×200）

3.2 PCPS對HepG2細胞活力的影響與空白組比較，10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS處理后，細胞活力明顯降低（P＜0.05），但5 mL·kg-1PCPS處理后細胞活力無明顯變化。見圖2。

圖2 PCPS對HepG2細胞活力的影響

3.3 PCPS對HepG2細胞增殖的影響與空白組比較，10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS組細胞增殖率明顯降低（P＜0.05），但5 mL·kg-1PCPS組細胞增殖率無明顯變化。見圖3。

3.4 PCPS對HepG2細胞凋亡的影響與空白組比較，10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），但5 mL·kg-1PCPS組細胞凋亡率無明顯變化。見圖4。

圖4 PCPS對HepG2細胞凋亡的影響

3.5 PCPS對HepG2細胞侵襲的影響與空白組比較，10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS組細胞侵襲率明顯降低（P＜0.05），但5 mL·kg-1PCPS組細胞侵襲率無明顯變化。見圖5。

圖5 PCPS對HepG2細胞侵襲的影響

3.6 PCPS對HepG2細胞p27和Survivin蛋白表達的影響與空白組比較，10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS組細胞中p27蛋白表達水平顯著上調（P＜0.05），Survivin蛋白表達水平顯著下調（P＜0.05），但5 mL·kg-1PCPS組細胞中p27和Survivin蛋白表達水平無明顯變化。見圖6。

圖6 PCPS對HepG2細胞p27和Survivin蛋白表達的影響

3.7 PCPS對HepG2細胞中上皮間質轉化蛋白表達的影響與空白組比較，10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS組細胞中E-cadherin蛋白的表達水平顯著上調（P＜0.05），而N-cadherin和Vimentin的蛋白表達水平顯著下調（P＜0.05），但5 mL·kg-1PCPS組上述蛋白表達水平無明顯變化。見圖7。

圖7 PCPS對HepG2細胞中上皮間質轉化蛋白表達的影響

4 討論

由于對腫瘤的認識不足，多數肝癌患者確診時已進入中晚期，錯失治療的最佳時期，臨床治療時常加大化療劑量，控制肝癌細胞，但其毒副作用也非常明顯［12］。同時，長期化療可導致腫瘤細胞產生耐藥，使治療效果不佳［13］。因此，尋求安全、有效的治療藥物，一直是醫學界的研究熱點。隨著各類腫瘤細胞和腫瘤動物模型研究的日益成熟，中藥以其療效肯定，藥性溫和，持續時間長的特點，在腫瘤康復治療中展現出獨特的優勢［14-15］。龔正等［16］觀察不同中藥復方聯合鹽酸埃克替尼治療晚期非小細胞肺癌療效發現，艾愈膠囊（山慈菇、白英、當歸等）或復方斑蝥膠囊（斑蝥、人參、黃芪等）聯合鹽酸埃克替尼的療效均優于單用鹽酸埃克替尼，且不增加藥物的副作用。山慈菇是蘭科植物杜鵑蘭和獨蒜蘭的假球莖，在臨床上多以復方入藥，用于腫瘤的治療。現代藥理研究顯示，山慈菇提取的單體成分具有抗腫瘤作用，可通過細胞毒作用抑制腫瘤細胞增殖與侵襲轉移、抑制新生血管生成、誘導其凋亡及免疫調節等［17］。Liu等［18］從杜鵑蘭醇提物中分離的雙菲類化合物對乳腺癌細胞BT474和SKBR3有明顯的細胞毒性。姜爽等［19］觀察到山慈菇多糖對小鼠骨肉瘤細胞S180具有明顯的抑瘤作用，可能與提高機體免疫力有關。中藥藥理研究中，含藥血清藥理研究也是一種體外實驗法，可明顯克服粗體物體外實驗的干擾，更為接近中藥在體內環境中產生藥理效應的真實過程［20］。陳思等［21］通過體外實驗發現，PCPS可有效抑制人乳腺癌細胞SK-BR-3的活性，加速細胞凋亡，并抑制其遷移能力。以上實驗充分肯定了山慈茹的抗腫瘤活性，但PCPS在肝癌中的抗腫瘤作用及其機制尚不完全清楚，因此，本研究通過體外實驗探究PCPS對肝癌細胞惡性生物學特征的影響及相關作用機制。

癌細胞生長、增殖、侵襲是腫瘤惡化的特征。本研究通過CCK8和EdU染色實驗發現，PCPS干預肝癌細胞后，可明顯抑制細胞的生長和增殖能力。p27蛋白是細胞周期負向調控因子的主要成員，主要對外部促進或抑制細胞增殖的信號起反應［22］。蛋白免疫印跡結果顯示，經PCPS處理后肝癌細胞中p27蛋白表達水平顯著上調，提示PCPS抑制肝癌HepG2細胞增殖可能與p27的激活有關。此外，在Transwell小室實驗中也發現，PCPS可顯著抑制肝癌細胞的侵襲能力。而癌細胞的侵襲、轉移與上皮間質轉化（epithe-lialmesenchyml transition，EMT）密切相關［23］。Ecadherin為上皮標志蛋白，Vimentin和N-cadherin為間葉標志蛋白，它們在細胞黏附、遷移等方面發揮重要作用［24］，其中，Ecadherin下調、Vimentin和Fibronectin上調被認為是EMT發生的重要標志［25-26］。在本研究中，經PCPS處理后，肝癌細胞中E-cadherin蛋白表達水平顯著上調，而N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平顯著下調，提示PCPS可能通過調控上皮間質轉化，抑制HepG2細胞的侵襲能力。

凋亡是細胞程序性死亡的一種形式，能有序和有效地去除受損細胞，與很多疾病的發病機制密切相關，包括癌癥［27-28］。在本研究中，通過凋亡實驗發現，PCPS處理HepG2細胞48 h后，細胞凋亡率明顯升高。Survivin蛋白作為重要的凋亡抑制因子，可直接抑制凋亡終末效應酶活性，阻斷細胞凋亡過程，還可與周期蛋白激酶相互作用阻滯凋亡信號通路［29］。蛋白免疫印跡發現，經PCPS處理后，HepG2細胞中Survivin蛋白表達水平明顯下調，提示PCPS可能通過下調Survivin蛋白的表達，從而誘導HepG2細胞的凋亡。此外，細胞偽足可促進細胞遷移、運動，偽足減少，貼壁生長的細胞會變圓脫落，從而促進細胞凋亡［30］。本研究通過光鏡下觀察各組細胞的形態發現，經PCPS處理的HepG2細胞偽足減少，細胞明顯增大。細胞體積逐漸增大，會使細胞腫脹破裂，導致凋亡。以上結果再次提示，PCPS可以促進肝癌細胞的凋亡。另外，本研究實驗中以10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS組效果更為顯著，提示山慈菇的臨床應用中需要注意其劑量，以保證其更好地發揮抗腫瘤作用。

綜上所述，PCPS可有效抑制HepG2細胞的增殖、侵襲能力，誘導凋亡，抑制其上皮間質轉化。