重灸對失眠模型大鼠下丘腦Orexin-A表達的影響*

時明偉，蔣西玲，史智君，王孟雨，陳新旺

1.河南中醫藥大學第三附屬醫院，河南 鄭州 450008；2.南陽市第二人民醫院，河南 南陽 473000；3.河南省人民醫院，河南 鄭州 450008；4.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046

目前，因社會節奏、生活壓力等諸多問題，失眠已成為最常見的睡眠障礙之一，影響從兒童到老年各個年齡階段的人。研究表明，至少33%的成年人出現間歇性失眠癥狀，10%～22%的成年人有慢性睡眠困難［1-3］。失眠的特點是難以入睡、難以保持睡眠、整晚頻繁醒來、醒來無法再入睡、睡眠無法恢復等，常合并有心血管疾病或抑郁、焦慮等情緒障礙。長時間的失眠狀態還會導致認知、社交和身體機能的下降，增加工作事故，甚至有自殺傾向［4-5］。因此，失眠的機制研究及適宜干預方法的探討是臨床研究的重點。

睡眠是一個周期性的、節律性的復雜生理過程，由自身生物鐘和機體平衡機制嚴格調控，睡眠/覺醒周期與神經元突觸結構和生理變化密切相關，腦內的相關神經遞質通過調節神經元活動來控制睡眠與覺醒［6］。研究表明，下丘腦小分子神經肽可能在維持睡眠覺醒的觸發開關中具有重要作用［7-8］，參與睡眠-覺醒的調節。Orexin覺醒纖維最重要的作用是維持覺醒，當其功能被抑制時，則覺醒減少，睡眠增加［9］，反之則會維持覺醒狀態。艾灸療法在臨床治療失眠中效果顯著，且當艾灸使用量增加時效果尤甚［10-11］。本研究通過采用重灸法來觀察下丘腦組織中Orexin-A蛋白表達的變化情況，以闡述重灸在失眠治療中的作用及對Orexin-A表達的影響，為進一步探討灸法在治療失眠中的作用機制提供依據。

1 材料

1.1 動物SPF級雄性SD大鼠40只，體質量（200±10）g，山東魯抗醫藥股份有限公司提供，生產批號：SCXK（魯）-20140007。大鼠飼養于河南中醫藥大學動物實驗中心，自由攝取食物和水，室溫22℃，濕度20%～30%，12 h/12 h明暗交替。

1.2 藥物與試劑對氯苯丙氨酸（美國Sigma公司，批號：SHBH7873）；兔抗大鼠Orexin-A多克隆抗體、生物素標記山羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BA2677-1、BA1005）；即用型SP免疫組化染色試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司，貨號：SPN-9001）；枸櫞酸緩沖液（上海信裕生物科技有限公司，貨號：90801A-20）；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、TBST緩沖液、PBST緩沖液（上海源葉生物科技有限公司，貨號：R20857、R21284、R20863）；精制細艾絨（南陽漢醫艾絨廠）。

1.3 儀器清鈴撳針（規格：0.3×0.2 mm，固始公元醫療器械有限公司，注冊號：豫食藥監械（準）字2010第2270165號）；BX53型顯微圖像采集系統（日本Olympus公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 分組造模與干預將大鼠按體質量隨機分為5組，即空白組、模型組、重灸組、針刺組和溫和灸組，每組8只。調節生理鹽水的pH至7～8，將對氯苯丙氨酸配置成30 g·L-1的混懸液。除空白組外，其余組大鼠按10 mL·kg-1的劑量腹腔注射對氯苯丙氨酸溶液，每天1次，連續2 d，建立失眠大鼠模型。造模成功后，將大鼠固定在特制鼠籠中，使其不能來回移動，于每天下午14點開始干預。重灸組大鼠背俞穴位置剃毛，涂抹大蒜汁，一次性灸至破潰或化膿后單籠飼養，期間不進行任何處理；針刺組在背俞穴應用撳針治療，膠帶固定，防止撳針脫落，每2天更換一次；溫和灸組于背俞穴處進行常規溫和灸治療，每次艾灸10 min，灸至皮膚微微潮紅為度，每天1次，連續6 d。空白組、模型組大鼠只固定不做其它處理。背俞穴選取雙側“心俞”“脾俞”“腎俞”穴位，定位參照余曙光主編的上海科學技術出版社《實驗針灸學》教材［12］。

2.2 免疫組化測定下丘腦組織中Orexin-A的表達每組取6只大鼠的部分下丘腦組織，固定，切片，片厚4μm，脫蠟，水化，PBS沖洗3次，滴加3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育10 min。蒸餾水漂洗2 min，PBS沖洗后抗原修復，放入枸櫞酸緩沖液，加熱沸騰，反復3次，冷卻30 min，PBS沖洗3次。正常山羊血清室溫孵育30 min，滴加Orexin-A一抗（1∶100），4℃過夜。室溫20 min，PBS沖洗2次，每次2 min，滴加羊抗兔IgG二抗（1∶100），PBS沖洗3次，每次3 min。DAB顯色，蒸餾水水洗2次，蘇木素輕度復染2 min，中性樹膠封片。顯微鏡觀察切片，每張切片隨機選取5個不同的視野，用Image-ProPlus 6.0病理圖像分析軟件，根據染色面積和強度進行半定量分析，結果用光密度（optical density，OD）值表示。

2.3 Western Blot檢測Orexin-A的表達各組取6只大鼠的部分下丘腦組織，蛋白裂解、提取、研磨、離心、取上清液，測蛋白濃度后配膠、上樣，進行轉膜。5%脫脂牛奶封閉1 h，加入稀釋后的一抗，4℃過夜。TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，二抗室溫孵育1 h；PBST緩沖液洗凈二抗，進行化學發光、顯影、定影，膠片掃描，應用Gel-proPlus軟件計算目的蛋白和內參蛋白β-actin的光密度值，進行數據統計分析。

2.4 統計學方法用SPSS 20.0軟件對結果進行統計學處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有極顯著性差異。

3 結果

3.1 Orexin-A蛋白免疫組化染色結果與空白組比較，模型組大鼠下丘腦組織中Orexin-A的蛋白表達顯著升高（P＜0.05），說明模型制備成功。與模型組比較，重灸組、針刺組、溫和灸組大鼠下丘腦組織中Orexin-A的蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與重灸組比較，溫和灸組與針刺組大鼠下丘腦組織中Orexin-A的蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與針刺組比較，溫和灸組大鼠下丘腦組織中Orexin-A的蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。提示，重灸可明顯降低失眠模型大鼠下丘腦組織中Orexin-A的蛋白表達水平。見表1、圖1。

表1 各組大鼠下丘腦組織中Orexin-A陽性表達細胞的OD值比較 （±s）

表1 各組大鼠下丘腦組織中Orexin-A陽性表達細胞的OD值比較 （±s）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與重灸組比較，▲P＜0.05；與針刺組比較，▽P＜0.05

Orexin-A空白組組別 n 0.12±0.01模型組 6 0.52±0.01△重灸組 6 0.23±0.01*針刺組 6 0.28±0.01*▲溫和灸組 6 0.41±0.01*▲▽6

圖1 各組大鼠下丘腦組織中Orexin-A陽性細胞表達免疫組化檢測圖（×200）

3.2 Orexin-A蛋白W estern Blot檢測結果與空白組相比，模型組大鼠下丘腦組織中Orexin-A的蛋白表達水平顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，重灸組、針刺組和溫和灸組大鼠下丘腦組織中Orexin-A的蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與重灸組比較，針刺組和溫和灸組大鼠下丘腦組織中Orexin-A的蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與針刺組比較，溫和灸組大鼠下丘腦組織中Orexin-A的蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。提示，重灸可抑制失眠模型大鼠下丘腦組織中Orexin-A蛋白的表達。見圖2、圖3。

圖2 W estern Blot檢測各組大鼠下丘腦組織中Orexin-A的表達

圖3 Orexin-A蛋白表達的比較

4 討論

Orexins也被稱為食欲素，包含Orexin-A和Orexin-B，位于下丘腦外側，屬于兩個孤兒G蛋白偶聯受體Orexin-1（OX1R）和Orexin-2（OX2R）的內源性配體，最初被認為是與攝食行為有關，但其主要作為睡眠/覺醒周期的關鍵調節器，其纖維末梢及受體廣泛分布于包括大腦皮層在內的眾多腦區［13-14］。Orexins系統與膽堿能、單胺能神經元之間存在廣泛的聯系，參與多種神經遞質的調節，如乙酰膽堿、組胺、去甲腎上腺素、羥色胺和多巴胺等，組成一個控制睡眠-覺醒的復雜網絡［15-16］。OX1R在海馬區、下丘腦旁核、下丘腦腹內側核、背縫核、藍斑等腦區表達；OX2R主要存在大腦皮質、海馬、背縫核和許多下丘腦核，包括室旁核和結節乳頭體核，而背縫核、藍斑、結節乳頭體核是眾所周知的覺醒開始區［17-19］。研究表明，敲除Orexins基因的小鼠、貓均會出現嗜睡癥狀［20-21］。在藍斑、背外側被蓋核、腦室或側腦室注射Orexin則可引起睡眠減少，覺醒增加的情況，這與Orexin-A能夠作用于下丘腦多個內穩態中心，增加神經電活動，抑制快動眼睡眠，提高覺醒度有關［22］。

古代醫籍中關于“重灸法”記載甚多，《小品方》記載“取穴甚少，灸壯甚多”［23］；《備急千金要方·婦人方》：“婦人胞落頹，灸臍中三百壯”［24］，提出施灸時要注重艾灸的量，施灸時的壯數根據情況可多達幾百壯。古人認為，只有灸得發瘡，疾病才得以痊愈。《針灸資生經》中云：“凡著艾得灸瘡發，所患即差，不得瘡發，其病不愈”［25］。古代醫家在施灸時都要求灸量充足、得氣。《醫宗金鑒·刺灸心法要訣》記載：“凡灸諸病，必火足氣到始能愈”［26］。“重灸法”是根據古人大病用大劑量艾灸，以及在治病時強調“灸瘡必發，去病如把抓”的觀點，使得灸治能夠達到相應的刺激，更好的調整臟腑功能。現代臨床研究發現，針對一些頑固性疾病和慢性病，在進行針灸治療時，加大灸量達到適合的刺激強度才能發揮灸法的作用［27-28］。不同的灸量對皮下組織影響的差異性、疼痛閾、巨噬細胞吞噬能力、微循環、免疫應答等可產生不同的效果［29-30］。失眠癥屬于一種慢性病癥，長時間不愈會導致全身臟腑的損害，本課題根據重灸法思想，將發灸瘡設定為刺激強度，作用于心俞穴、脾俞穴、腎俞穴，起到調心安神、健脾益氣、交通心腎等作用，使機體臟腑經絡調和通達，氣血平和順暢，機體歸于“陰平陽秘”，寤寐有節的狀態。本研究結果顯示，Orexin-A蛋白在失眠模型大鼠中的表達增加，大鼠保持覺醒的狀態；通過重灸、針刺、溫和灸的干預后，Orexin-A的表達明顯降低，其中以重灸對Orexin-A蛋白表達的影響最為明顯，其次是針刺組、溫和灸組。提示，重灸對于失眠的干預效果最好。

綜上所述，重灸可改善失眠模型大鼠下丘腦Orexin-A的蛋白表達，進而影響大鼠的睡眠，改善睡眠質量。本研究為重灸治療失眠的作用提供了實驗依據，為進一步研究灸法的量效關系提供了借鑒，但重灸治療失眠的作用機制還有待進一步深入研究。