基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討補陽還五湯治療強直性脊柱炎的作用機(jī)制*

李偉，李春根，穆曉紅，陳黎明，趙子義

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）屬于主要累及中軸關(guān)節(jié)的慢性自身免疫性疾?。?］，主要的病理過程是骶髂關(guān)節(jié)、脊柱及附近肌腱、韌帶骨附著點的慢性炎癥并繼發(fā)纖維化、骨化及新骨形成［2］。目前此病的病因、病機(jī)尚不明確，考慮與遺傳、自身免疫、感染、內(nèi)分泌紊亂等因素相關(guān)［3-4］。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，我國的發(fā)病率為0.3%［5］左右，且男性較女性多發(fā)，男女發(fā)病比例約為3∶1［6］。目前，尚無此病的根治辦法，治療上主要以控制患者臨床癥狀，延緩病情發(fā)展，改善預(yù)后為主。西醫(yī)治療藥物主要有緩解病情抗風(fēng)濕藥（disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDs）、非甾體類抗炎藥（nonsteroidal antiinflammatory drugs，NASIDs）、糖皮質(zhì)激素、生物制劑等。非甾體類抗炎藥，是治療強直性脊柱炎的首選藥物，可以明顯緩解患者疼痛、晨僵等癥狀，但是不能阻止病情的進(jìn)展并且長時間使用會導(dǎo)致胃腸道不良反應(yīng)與肝腎功能損害［7］。緩解病情抗風(fēng)濕類藥，目前臨床上主要使用的是氨甲蝶呤、柳氮磺吡啶等，可以有效改善患者病情［8］。但是Zochling等［9］研究發(fā)現(xiàn)，目前缺乏明確的證據(jù)證明緩解病情抗風(fēng)濕類藥物對于AS患者中軸病變有效。生物制劑以其強大的抗炎及其免疫抑制作用在治療AS方面具有廣大的應(yīng)用前景，但一旦停用可能導(dǎo)致病情加重而且價格昂貴［10］。中醫(yī)藥治療AS疾病具有獨特的優(yōu)勢。

中醫(yī)學(xué)并無“強直性脊柱炎”病名，多將其歸屬于“骨痹”“大僂”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病屬于本虛標(biāo)實之證，腎督空虛為本，感受外邪為標(biāo)［11］，風(fēng)寒濕邪留滯筋骨關(guān)節(jié)，陽氣不足，瘀血痰濁內(nèi)生，脈絡(luò)瘀阻［12］。治療當(dāng)以“標(biāo)本兼治”為原則。補陽還五湯是《醫(yī)林改錯》的經(jīng)典方劑，具有補氣活血通絡(luò)之功效，是治療強直性脊柱炎的常用方劑，均取得了較好的臨床療效。陳倩倩等［13］研究發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯可以降低AS患者血紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C反應(yīng)蛋白（C-reactiveprotein，CRP）水平，改善胸廓、脊柱關(guān)節(jié)活動度及臨床癥狀。相關(guān)動物實驗表明補陽還五湯能夠通過下調(diào)小鼠血清Rho激酶活性，抑制ROCK1（recombinant rho associated coiled coil containing protein Kinase 1）、TF（recombinant tissue factor）、MMP-2（matrix metallopeptidase-2）、MMP-9（matrix metallopeptidase-9）等AS相關(guān)基因介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖，最終抑制AS病變的形成與發(fā)展［14］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究亦表明，補陽還五湯具有擴(kuò)張血管，抑制血小板聚集，改善局部微循環(huán)等作用［15］。目前，補陽還五湯治療強直性脊柱炎的主要活性成分及其分子機(jī)制未見系統(tǒng)描述。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門新興學(xué)科，是基于分子層面，通過數(shù)據(jù)可視化分析，構(gòu)建藥物-有效成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)來預(yù)測藥物治療疾病的作用機(jī)制，彌補了“單成分、單靶點、單藥物、單疾病”研究模式的不足。因此，本次研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測補陽還五湯治療強直性脊柱炎的有效成分、作用靶點、關(guān)鍵通路，并解釋其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 補陽還五湯藥物化學(xué)成分及其相關(guān)靶點的搜集采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional chinesemedicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）、中藥分子機(jī)制綜合數(shù)據(jù)庫（traditional Chinese medicine integrated database，TCMID）、中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具（a Bioinformatics Analysis Tool for MolecularmechANism of Traditional Chinese Medicine，BATMANTCM），檢索補陽還五湯組成藥物活性化學(xué)成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-like，DL）≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)對所有活性成分進(jìn)行篩選，并搜集有效化學(xué)成分相關(guān)靶點。

1.2 強直性脊柱炎疾病靶點的搜集通過人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards）、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（onlinemendelian inheritance in man，OMIM）、治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫（therapeutic target database，TTD）、DrugBank數(shù)據(jù)庫，以“Ankylosing spondylitis”為關(guān)鍵詞搜集強直性脊柱炎的疾病靶點。刪除重復(fù)的靶點，導(dǎo)入Uniprot（Universal Protein）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3 藥物-疾病交集靶點、韋恩圖及活性成分-作用靶點的構(gòu)建將補陽還五湯有效成分相關(guān)靶點及強直性脊柱炎疾病靶點導(dǎo)入venny 2.1.0在線作圖工具，獲得藥物-疾病交集靶點及其韋恩圖并將其交集靶點、有效成分，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，對藥物有效成分相關(guān)靶點-疾病相關(guān)靶點進(jìn)行映射，構(gòu)建活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖?；钚猿煞帧⒆饔冒悬c用“節(jié)點”表示，節(jié)點之間的相互關(guān)系用“邊”表示。

1.4 蛋白互作（protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將藥物-疾病的交集靶點導(dǎo)入STRING軟件中（https：//string-db.org），選擇置信度score≥0.400，隱藏游離的節(jié)點。下載TSV數(shù)據(jù)文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化分析，使用cytoHubba插件的MCC算法找出PPI網(wǎng)絡(luò)的核心基因。

1.5 GO生物功能及KEGG信號通路富集分析采用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫（The database for annotation，visualization and integrated discovery）對藥物、疾病的交集靶點進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）生物功能與京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集分析，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)為P值小于0.05，使用imageGP作圖軟件對pvalue值最小的前20條結(jié)果制作氣泡圖進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 補陽還五湯藥物化學(xué)成分及其相關(guān)靶點通過TCMSP、TCMID、BATMAN-TCM 3個數(shù)據(jù)庫結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)檢索，共獲得補陽還五湯藥物化學(xué)成分106個，其中赤芍29個，川芎7個，當(dāng)歸尾2個，地龍3個，紅花22個，黃芪20個，桃仁23個；共獲取相關(guān)靶點1 031個。

2.2 強直性脊柱炎疾病靶點搜索結(jié)果通過GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank等數(shù)據(jù)庫并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，獲得疾病靶點2 148個，其中DrugBank數(shù)據(jù)庫101個，GeneCards數(shù)據(jù)庫1 994個，OMIM數(shù)據(jù)庫50個，TTD數(shù)據(jù)庫3個，刪除重復(fù)的靶點，最終獲得強直性脊柱炎疾病靶點2 093個。

2.3 藥物-疾病交集靶點、韋恩圖及藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)將補陽還五湯藥物成分相關(guān)靶點、強直性脊柱炎疾病相關(guān)靶點導(dǎo)入venny 2.1.0在線作圖工具，共獲得雌激素受體-1（estrogen receptor 1，ESR1）、雄激素受體（Androgen Receptor，AR）、RELA蛋白（v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A，RELA）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metallopeptidase-2，MMP2）等82個交集靶點及韋恩圖（見圖1）；將藥物-疾病交集靶點與藥物有效成分相互作用關(guān)系及屬性文件導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件并進(jìn)行映射，構(gòu)建藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2）；根據(jù)Cytoscape軟件NetworkAnalyzer分析工具算出有效成分degree值，degree值越大表示節(jié)點的重要性越大。藥物有效成分degree值位于前5位的分別為槲皮素（quercetin）為56，山柰酚（kaempferol）為24，木樨草素（luteolin）為21，黃芩素（baicalein）為14，芒柄花黃素（formononetin）為12。見表1。

圖2 補陽還五湯治療強直性脊柱炎“有效成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

表1 補陽還五湯藥物有效成分及OB、DL值（degree值前10位）

圖1 補陽還五湯-強直性脊柱炎交集靶點及韋恩圖

2.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)結(jié)果將藥物-疾病的82個交集靶點導(dǎo)入STRING軟件中，擇置信度score≥0.400，下載TSV數(shù)據(jù)文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，共得到82個節(jié)點，1 121條邊，使用cytoHubba插件的MCC算法找出PPI網(wǎng)絡(luò)的核心基因，VEGFA、IL-10、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP9）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）等基因為PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因。見圖3、圖4。

圖3 補陽還五湯治療強直性脊柱炎作用靶點蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 補陽還五湯治療強直性脊柱炎前10位核心靶點蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 補陽還五湯治療強直性脊柱炎作用靶點GO生物功能富集分析結(jié)果采用DAVID數(shù)據(jù)庫對補陽還五湯治療強直性脊柱炎作用靶點進(jìn)行GO生物功能富集分析，共獲得P＜0.05的GO功能條目366條，其中生物過程（biological process，BP）284條，細(xì)胞組分（cellular component，CC）31條，分子功能（molecular function，MF）51條。生物過程主要富集在細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，DNA模板化、對藥物的反應(yīng)等；細(xì)胞組分主要富集在細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、質(zhì)膜外側(cè)、膜筏、細(xì)胞器膜等；分子功能主要富集在酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子活性、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性，配體激活序列特異性DNA結(jié)合、類固醇激素受體活性等。見圖5、圖6、圖7。

圖5 補陽還五湯治療強直性脊柱炎作用靶點的BP分析示意圖

圖6 補陽還五湯治療強直性脊柱炎作用靶點的CC分析示意圖

圖7 補陽還五湯治療強直性脊柱炎作用靶點的MF分析示意圖

2.6 補陽還五湯治療強直性脊柱炎作用靶點KEGG信號通路富集分析結(jié)果通過DAVID數(shù)據(jù)庫對補陽還五湯治療強直性脊柱炎作用靶點進(jìn)行KEGG信號通路富集分析，刪除“cancer”相關(guān)通路，共獲得P＜0.05的KEGG信號通路87條，根據(jù)P值對前30條信號通路繪制氣泡圖。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)核因子κB（nuclear factor-k-gene binding，NFκB）信號通路、核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域（nucleotide oligomerzation domain，NOD）樣受體信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用等信號通路是補陽還五湯治療強直性脊柱炎的關(guān)鍵通路。見圖8。前10位信號通路富集細(xì)節(jié)見表2。

表2 補陽還五湯治療請直性脊柱炎前10位信號通路富集細(xì)節(jié)表

圖8 補陽還五湯治療強直性脊柱炎作用靶點的KEGG富集分析示意圖

3 討論

強直性脊柱炎的病機(jī)為腎督空虛，陽氣不足，風(fēng)寒濕外邪侵襲，留滯筋骨關(guān)節(jié)，痰濁瘀血內(nèi)生阻于脈絡(luò)［11-12］。補陽還五湯是治療AS的經(jīng)典方劑，方中黃芪大補元氣，氣行則血行，瘀去則絡(luò)通為君藥；當(dāng)歸活血而補血，化瘀而不傷正為臣藥；桃仁、紅花、赤芍、川芎、地龍活血祛瘀，通經(jīng)活絡(luò)為佐藥，共奏補氣活血通絡(luò)之良效。本次研究，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，共獲得補陽還五湯藥物活性成分106個，通過可視化分析并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)獲悉槲皮素、山柰酚、木樨草素、黃芩素、芒柄花黃素等成分是補陽還五湯治療強直性脊柱炎的關(guān)鍵藥物成分。槲皮素屬于黃酮類化合物，相關(guān)研究證實槲皮素具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)等作用［16］。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以抑制人體外周血單核細(xì)胞促炎細(xì)胞因子TNF-α的增殖及基因水平，降低IL-1β、IL-6等炎癥因子以及MMP3、MMP9的表達(dá)，抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而改善炎癥癥狀［17-18］。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過抑制小鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞MMP9、MMP2的活化，具有改善疼痛的作用［19］。山柰酚、芒柄花黃素通過下調(diào)MMP9、抗酒石酸酸性磷酸酶、整合素β3，抑制破骨細(xì)胞骨吸收相關(guān)蛋白與基因的表達(dá)水平及單核巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞的增殖分化，具有骨保護(hù)作用［20-21］。此外山柰酚還可以降低FGFR3活性，抑制堿性成纖維細(xì)胞因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）對FGFR3-RSK2信號軸的激活水平，調(diào)控滑膜細(xì)胞的增殖遷移及T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子IL-7、IL-21、TNF-α的釋放，緩解炎癥反應(yīng)［20］。研究發(fā)現(xiàn)，木樨草素通過調(diào)控NF-κB通路和M1巨噬細(xì)胞極化，抑制巨噬細(xì)胞促炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-12、TNF-α的釋放而緩解炎癥癥狀［22］；動物研究還發(fā)現(xiàn)，木樨草素通過抑制脂多糖介導(dǎo)的NF-κB通路可以減緩細(xì)胞凋亡［23］；Kritas等［24］研究證明木樨草素具有抗氧化作用，可以抑制肥大細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥及過敏反應(yīng)。黃芩素具有抗炎、抗菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗癌等作用，黃芩素屬于黃嘌呤氧化酶抑制劑，有效抑制黃嘌呤氧化過程中的產(chǎn)生的氧自由基，其具備的羥基結(jié)構(gòu)也賦予了其自由基清除活性［25-26］。張海麗等［27］通過動物實驗研究證實，黃芩素可以抑制脂多糖、三磷酸腺苷誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

此外，黃芩素通過調(diào)控花生四烯酸代謝通絡(luò)，抑制環(huán)氧煤、脫氧酶、核因子及細(xì)胞因子的產(chǎn)生而發(fā)揮強大的解熱鎮(zhèn)痛作用［26］。

通過藥物-疾病作用靶點富集分析結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯治療強直性脊柱炎關(guān)鍵靶點基因為VEGFA、IL-10、MMP9、PTGS2等。章敏等［28］研究發(fā)現(xiàn)VEGF等增殖與遷移，介導(dǎo)了骨與軟骨的損傷。IL-10是理想的抗炎因子，Rabelo等［29］研究發(fā)現(xiàn)，在接受治療的AS患者中IL-10呈現(xiàn)高表達(dá)水平，代表了抑制性反饋途徑及對炎癥的抑制反應(yīng)，Tian等［30］通過動物實驗發(fā)現(xiàn)IL-10還具有抑制滑膜增殖及促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)作用。MMP9屬于蛋白水解酶家族，通過對膠原、蛋白多糖、細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用，導(dǎo)致了骨組織及關(guān)節(jié)軟骨的破壞，此外，由于對細(xì)胞外介質(zhì)膠原蛋白的破壞作用，導(dǎo)致細(xì)胞屏障的破壞，血管通透性增加和機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生［31-32］。PTGS2的高表達(dá)會導(dǎo)致成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的增殖，影響血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)水平，加劇炎癥反應(yīng)［33］。通過對藥物-疾病作用靶點的GO生物功能富集分析結(jié)果，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)、類固醇激素受體活性等生物功能與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖具有抗原性，具有刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)黏附分子、細(xì)胞趨化因子、炎癥細(xì)胞因子在局部關(guān)節(jié)的聚集，導(dǎo)致機(jī)體對自身蛋白聚糖的免疫反應(yīng)［34］。類固醇激素包括雄激素、雌激素、孕激素等，研究發(fā)現(xiàn)類固醇激素通過激活類固醇激素受體啟動轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，通過神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的作用，為神經(jīng)元提供營養(yǎng)支持及神經(jīng)保護(hù)［35］。

通過對補陽還五湯治療強直性脊柱炎的作用靶點，進(jìn)行KEGG富集分析并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)NF-κB信號通路、NOD樣受體信號通路、HIF-1信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用等通路是補陽還五湯治療強直性脊柱炎的關(guān)鍵通路。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號通路在強直性脊柱炎的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，其主要機(jī)制是，一方面活化的NF-κB信號通路加速了TNF-α、IL-8、黏附細(xì)胞因子等炎癥介質(zhì)的基因表達(dá)，加劇了炎癥反應(yīng)；另一方面阻斷成纖維滑膜樣細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)了成纖維滑膜樣細(xì)胞的增殖［36］。核苷酸結(jié)合寡聚域（nucleotide oligomerzation domain，NOD）樣 受 體（NOD-like Receptors，NLRs）主要存在于機(jī)體免疫細(xì)胞及上皮細(xì)胞中，在調(diào)控機(jī)體免疫及炎癥反應(yīng)方面具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，NLR激活后形成高分子復(fù)合體，通過受體相互作用蛋白2，進(jìn)一步激活NF-κB信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPK）信號通路，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生；此外，NOD作為細(xì)胞內(nèi)模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR），通過識別細(xì)胞壁胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）成分參與機(jī)體固有免疫反應(yīng)，也介導(dǎo)了炎癥介質(zhì)的釋放［37-38］。吳洪亮［39］通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α通過活化BMP信號通路，促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的成骨分化，抑制骨小梁破損，具有良好的骨組織修復(fù)作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子受體作用蛋白通過活化TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、驅(qū)動細(xì)胞壞死、壞死非依賴途徑調(diào)節(jié)炎癥小體形成等機(jī)制介導(dǎo)了細(xì)胞壞死及機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生［40］。

綜上所述，補陽還五湯治療強直性脊柱炎主要是通過槲皮素、山柰酚、木樨草素、黃芩素、芒柄花黃素等活性成分作用于VEGFA、IL-10、MMP9、PTGS2等靶點基因，從而調(diào)節(jié)多條生物學(xué)功能與信號通路，最終達(dá)到治療作用。但是，此次研究尚存在不足之處，需要后期進(jìn)一步實驗驗證。