菠菜NHX家族基因鑒定及其響應鹽脅迫的表達分析

李茹霞，顧寅鈺，李萌，陳傳杰，梁曉艷，李俊林，邢延富，張海洋，付嬈

（1.山東省蠶業研究所，山東 煙臺 264002；2.煙臺市福山區農業農村局，山東 煙臺 265500）

土壤鹽漬化作為一個普遍的環境問題，已經成為制約農業生產力的世界性難題［1，2］。對于大部分植物來說，高鹽脅迫的危害主要是由高濃度Na＋積累導致的。雖然不同植物的耐鹽機制存在差異，但其基本策略都是保持胞內Na＋的平衡［3］。

離子和pH穩態在植物生長發育的細胞過程中起著重要的調節作用，離子運輸在生物過程的許多方面起著至關重要的作用，如離子的吸收或隔離、提供能量和細胞的擴展。最佳離子和pH梯度取決于H＋轉運酶和陽離子/H＋交換器［4］。在眾多的單價陽離子/質子逆向轉運（CPA1）家族中，Na＋/H＋逆向轉運蛋白（NHX）為二次離子轉運體，是離子轉運體中的重要成員，在細胞的各個隔間中介導H＋與Na＋/K＋在膜上的交換轉運［5］。根據已有研究，除了酵母只含有一個NHX基因外，所有已測序的真核生物都含有多個NHX家族成員，并被指定為Na＋/H＋交換器（NHEs）［6，7］。根據其家族成員的亞細胞定位，NHXs分為3類:定位于液泡膜上的（Vac－class）、定位于核內體膜上的（Endo－class）和定位于質膜上的（PMclass）［8］。在哺乳動物中，NHXs的特殊亞細胞功能依賴于其器官特異性的分布［9］。

在擬南芥中，NHX家族由6個細胞內基因（其中AtNHX1～AtNHX4屬于Vac－class，At-NHX5、AtNHX6屬于Endo－class）和2個質膜結合基因（AtNHX7、AtNHX8）組成［10］。根據生化和動力學分析，NHXs含有10～12個跨膜結構域，在功能上可能具有同源二聚體功能［9］。雖然At-NHX1在拓撲結構特征上與其他已知的NHXs逆向轉運蛋白不同，但根據疏水性分析，它仍然含有10～12個跨膜結構域［11］。

NHXs基因參與多個生物過程，包括對外界鹽脅迫的響應［10－12］，從植物體內pH穩態［12，13］、K＋穩態［14，15］、細胞擴張［16，17］、細胞囊泡的轉運等多個方面影響植物的生長發育［4，9］。擬 南 芥nhx1nhx2雙突變體幼苗與單突變體和野生型幼苗相比，生長速度明顯降低；顯微觀察結果顯示，nhx1nhx2雙突變體各組織的細胞擴張均明顯減弱，特別是在快速伸長的器官中，如花絲和黃化下胚軸［18］。另外，nhx1nhx2雙突變體對外源K＋敏感，表現出根卷曲、葉片黃化膨大等表型［18，19］。Endo亞家族的AtNHX5和AtNHX6定位于跨高爾基體網絡（TGN），在囊泡運輸（尤其是在液泡運輸中）起著關鍵的調節作用［7］。在鹽脅迫下，細胞外高濃度的鈉離子流入細胞，當Na＋積累到有害水平時，PM亞家族的AtNHX（AtNHX7/SOS1）會主動將Na＋排出細胞，而Vac亞家族的AtNHXs則介導Na＋進入液泡，將Na＋隔離于液泡中［14］。

菠菜是重要的綠葉蔬菜之一，具有較高的經濟價值。菠菜基因組測序的完成和遺傳轉化體系的建立［20－22］，使得菠菜重要基因的功能研究成為可能。NHXs在菠菜體內的功能尤其是在維持Na＋平衡方面目前還沒有詳細研究報道。前期，我們通過生物信息學方法，從菠菜中鑒定出6個NHX家族基因，并進行系統進化樹分析及不同亞家族的基因結構與蛋白保守結構域分析，結果與擬南芥相似，但整個家族的基因數目少于擬南芥，該家族基因的生物學功能還未明確。為了探究菠菜NHXs在功能上的差異，本研究對其進行了系統的生物信息學分析，可為進一步研究菠菜NHXs基因的進化和功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菠菜品種為保存的山東小葉菠菜品種，2020年9月播種于山東省蠶業研究所植物光照培養箱中，待幼苗四葉一心時，分別置于正常條件及200 mmol/L NaCl脅迫條件下進行處理，重復3次。處理0、3、6、12 h后選取幼嫩植株作為樣品，經液氮速凍后，置－80℃保存備用。

1.2 菠菜NHX家族相關生物信息學分析及進化樹構建

以已知的8個擬南芥NHX蛋白（TAIR，https://www.arabidopsis.org/browse/genefamily/index.jsp）對菠菜基因組（SpinachBase，http://www.spinachbase.org/）進行Blast，并通過SMART（http://smart.embl－heidelberg.de/）和Pfam工具（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer）鑒定菠菜NHX基因。使用Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2）進一步預測其跨膜結構域數量。運用在線軟件GSDS 2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）繪制基因結構圖；運用Protparam（https://web.expasy.org/protparam/）在線網站進行氨基酸數、分子質量、理論等電點等預測；采用MEME（http://meme－suite.org/tools/meme）進行蛋白motif保守基序分析。通過TAIR與Phytozomev 12.1下載擬南芥（At）、水稻（Os）蛋白序列，使用MEGA 7.0軟件采用鄰接法（neighbor－joining，NJ）構建系統進化樹，進化標準Bootstrap值設置為1 000。

1.3 總RNA的提取、引物設計和qRT－PCR分析

從菠菜基因組數據庫中下載SpoNHX基因家族的CDS序列，利用Primer Premier 5.0進行熒光定量PCR引物設計（表1），引物由華大生物工程股份有限公司（青島）合成。采用Trizol法提取總RNA，采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000檢測RNA質量以確保總RNA的完整性和濃度。參照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉錄試劑盒說明書進行cDNA第一鏈合成，置于－20℃保存備用。qRT－PCR擴增選用熒光定量專用試劑TransStart?Top Green qPCR SuperMix（＋DyeⅡ）（北京全式金生物技術有限公司）。反應體系（20 μL）:2×qPCR SuperMix 10μL，上下游引物（10 μmol/L）各1μL，cDNA 1μL，ddH2O 7μL。反應程序:95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，44個循環；擴增完全后溫度從65℃緩慢上升至95℃進行熔解曲線繪制，上升速度為每0.05 s上升0.5℃。每次循環第3步進行熒光采集，每個樣品重復3次，利用2－△△Ct法進行數據分析，并使用SigmaPlot12.5繪制柱狀圖。

表1 菠菜NHX家族熒光定量PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 SpoNHX家族基因的鑒定和理化性質分析

通過將擬南芥中的NHX家族基因對菠菜基因組數據庫進行同源序列比對，并經保守結構域等分析，我們從菠菜中篩選到6個NHX家族基因，根據SpoNHX基因與AtNHX基因的親緣關系將其命名為SpoNHX1～SpoNHX6，其蛋白長度、等電點和相對分子質量等見表2。其中，ORF長度在236～1 162個氨基酸殘基之間，等電點在4.64～9.11之間。

表2 SpoNHX家族基因信息及理化性質

2.2 SpoNHXs的系統進化關系及跨膜結構預測

將擬南芥、水稻和菠菜的NHX氨基酸序列進行比對，并用MEGA 7.0進行系統發育進化樹的構建。結果表明，系統發育進化樹將3個物種的NHX蛋白聚類為3個亞家族（Vac、Endo和PM），Vac亞家族包含3個SpoNHXs、4個AtNHXs以及4個OsNHXs；Endo亞家族包含1個SpoNHX、2個AtNHXs以及2個OsNHXs；PM亞家族包含2個SpoNHXs、2個AtNHXs以及1個OsNHX（圖1）。該結果與其亞細胞定位結果相吻合。

圖1 菠菜、擬南芥、水稻的NHXs進化樹

利用Phyre2在線網站對鑒定出的SpoNHXs蛋白進行跨膜結構預測，結果表明，SpoNHX1～SpoNHX5含有13個跨膜結構域，而SpoNHX6只有6個跨膜結構域（圖2）。

圖2 SpoNHX家族蛋白的跨膜結構域

2.3 SpoNHX家族基因結構、蛋白的保守基序

對SpoNHX家族成員進行結構分析，結果表明6個SpoNHXs基因結構完整。SpoNHX1和SpoNHX2含有14個外顯子，SpoNHX3含有13個外顯子，SpoNHX4含有20個外顯子，SpoNHX5含有23個外顯子，SpoNHX6含有6個外顯子（圖3）。

圖3 SpoNHX家族基因結構

利用MEME軟件搜索并對SpoNHXs氨基酸序列進行保守基序分析，保守基序上限設置為15且允許序列中同一基序重復出現，結果（圖4）表明，SpoNHX與AtNHX不同亞家族保守基序基本一致，說明NHX成員間保守性較高；其中，Vac亞家族中的SpoNHX1和SpoNHX2含有11個保守基序，而SpoNHX3含有9個保守基序；Endo亞家族中的SpoNHX4含有8個保守基序；PM亞家族中的SpoNHX5含有9個保守基序，SpoNHX6含有3個保守基序。

圖4 SpoNHX家族蛋白基序分配

2.4 SpoNHXs基因鹽脅迫下的表達分析

為探索SpoNHXs對鹽脅迫的響應，采用qRTPCR檢測該家族基因受鹽脅迫0、3、6、12 h的表達情況，結果（圖5）發現，鹽脅迫后6個SpoNHXs基因均上調表達。其中SpoNHX1和SpoNHX6在鹽脅迫下表達呈現先升高后降低的趨勢，在6 h時表達最高，與對照相比差異顯著；而SpoNHX2～SpoNHX5在鹽脅迫下呈現一直上升的趨勢，與對照相比差異不顯著。

圖5 鹽脅迫下SpoNHX家族基因表達情況

3 結論

隨著基因組測序和生物信息學研究的不斷深入，越來越多物種中的NHX家族基因被鑒定出來并得到系統分析。本研究從菠菜中鑒定出6個NHX基因，分屬于Vac、Endo、PM亞家族，其中，SpoNHX1、SpoNHX2、SpoNHX3屬于Vac亞家族，SpoNHX4屬于Endo亞家族，SpoNHX5和SpoNHX6屬于PM亞家族。系統進化分析顯示，SpoNHXs與擬南芥NHXs在進化距離上較水稻NHXs更近，這可能與菠菜和擬南芥同屬于雙子葉植物而水稻屬于單子葉植物有關。SpoNHX1～SpoNHX5均含有13個跨膜結構域，SpoNHX6含有6個跨膜結構域。菠菜和擬南芥NHXs在不同亞家族中保守結構域高度一致，說明其可能具有相似的生物學功能。在鹽脅迫條件下，SpoNHXs均上調表達，其中SpoNHX1和SpoNHX6表達水平呈現先升高后降低的趨勢，且在脅迫處理6 h時顯著高于對照，說明這兩個基因在響應鹽脅迫中發揮著較為重要的作用。本研究結果為菠菜NHX家族基因的克隆及功能預測提供了一定的理論參考，并為菠菜耐鹽功能基因的深入研究奠定了理論基礎。