紅果肉蘋(píng)果‘紅脆甜’二倍體和四倍體葉片顯微結(jié)構(gòu)差異分析

馬榮群，葛紅娟，黃粵，孫紅濤，張蕊芬，孫吉祿，萬(wàn)述偉，沙廣利

（青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 青島 266100）

果樹(shù)多倍體品種一般具有生長(zhǎng)旺盛、果實(shí)大、產(chǎn)量高和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)［1］，且能夠利用無(wú)性繁殖方式保持其優(yōu)良性狀。果樹(shù)多倍體育種是創(chuàng)造果樹(shù)新品種的重要途徑之一。同源多倍體可直接育成品種，也可以在品種改良中充當(dāng)中間材料，或在多倍體水平進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)利用，以及用于創(chuàng)造新的種質(zhì)資源等［2］。紅果肉蘋(píng)果因富含具抗氧化作用的黃酮類(lèi)色素花青苷而備受人們青睞。

‘紅脆甜’是青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院育成的紅果肉蘋(píng)果二倍體品種，果實(shí)口感酸甜，且早花早果、植株干性強(qiáng)，高抗白粉病。前期本課題組以‘紅脆甜’為材料，通過(guò)秋水仙素誘導(dǎo)結(jié)合葉片離體再生，獲得其同源四倍體植株［3］，移栽到溫室后觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，‘紅脆甜’四倍體植株較二倍體植株的生物學(xué)性狀表現(xiàn)發(fā)生了明顯變化，葉片形狀、葉片顏色以及植株高度等明顯區(qū)別于二倍體，類(lèi)似于已報(bào)道的寒富蘋(píng)果［4］、大青楊［5］、枇杷［6］等的同源四倍體的表現(xiàn)。目前有關(guān)紅果肉蘋(píng)果‘紅脆甜’二倍體及其同源四倍體葉片顯微結(jié)構(gòu)差異的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)移栽至溫室的一年生‘紅脆甜’二倍體及同源四倍體的植株性狀和葉片顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)查，并對(duì)二者間的差異進(jìn)行分析，以期為深入探討紅果肉蘋(píng)果多倍體特性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蘋(píng)果砧木課題組自主選育的紅果肉蘋(píng)果‘紅脆甜’（CK）以及經(jīng)誘導(dǎo)鑒定的其3個(gè)同源四倍體材料F38、F50、F51。2019年6月，組培苗定植于現(xiàn)代化玻璃溫室；2020年9月，取溫室一年生‘紅脆甜’組培苗植株功能葉片為試驗(yàn)材料進(jìn)行相關(guān)觀(guān)察。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 表皮細(xì)胞及氣孔器的密度觀(guān)察 用鑷子輕輕撕取葉片上下表皮置于載玻片上，滴加I2－KI溶液染色30 s，加蓋玻片制成臨時(shí)裝片，在熒光顯微鏡拍照系統(tǒng)（WT－1000GM）放大100倍進(jìn)行觀(guān)察，四倍體和二倍體各取30個(gè)視野，分別記錄表皮細(xì)胞數(shù)和氣孔器數(shù)，取平均值，計(jì)算每個(gè)視野的平均表皮細(xì)胞數(shù)及氣孔器數(shù)目。

1.2.2 葉片結(jié)構(gòu)觀(guān)察 將葉片剪為1.0 cm×1.0 cm小塊，立即置于Carnoy’s固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1）中固定至葉片完全褪綠。采用常規(guī)石蠟切片制片，熒光顯微鏡鏡檢拍照，記錄100倍視野下葉片厚度、葉片主脈厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、上下表皮細(xì)胞厚度等。

1.2.3 植株性狀調(diào)查 2019年6月6日，同時(shí)將‘紅脆甜’二倍體及其同源四倍體組培苗定植于玻璃溫室，2020年9月4日調(diào)查植株性狀，測(cè)量株高、莖粗、葉片長(zhǎng)度和寬度。莖粗為地面上20 cm處莖的粗度，葉片測(cè)量第8～10片葉。溫室管理肥水充足。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片表皮細(xì)胞及氣孔器密度比較

由表1可知，二倍體表皮細(xì)胞平均密度為91.67個(gè)/視野，四倍體表皮細(xì)胞平均密度（46.00個(gè)/視野）比二倍體表皮細(xì)胞密度減少了49.82%。二倍體表皮氣孔器平均密度為30個(gè)/視野，而四倍體表皮氣孔器密度為16個(gè)/視野，比二倍體葉片表皮氣孔器密度減少了46.67%。由圖1、圖2可見(jiàn)，相比于紅果肉蘋(píng)果‘紅脆甜’二倍體，四倍體植株葉片的表皮細(xì)胞和氣孔器同步變大，從而使得密度變小。

圖2 二倍體（左）和四倍體（右）氣孔器

表1 ‘紅脆甜’二倍體、四倍體表皮細(xì)胞及氣孔器密度差異

圖1 二倍體（左）和四倍體（右）上表皮細(xì)胞

2.2 葉片橫切解剖結(jié)構(gòu)特征比較

由圖3可見(jiàn)，‘紅脆甜’二倍體（CK）和四倍體（F38、F50、F51）葉片上、下表皮均由1層細(xì)胞組成，上表皮較下表皮排列整齊；葉肉細(xì)胞中柵欄組織分兩層，多為長(zhǎng)橢圓形，排列緊密厚實(shí)，海綿組織排列松散，形狀不規(guī)則。如表2所示，與二倍體相比，四倍體上下表皮、柵欄組織和海綿組織厚度都顯著增加，其中，上表皮厚度增加58.37%～78.58%，下表皮厚度增加39.95%～63.19%，柵欄組織厚度增加41.75%～64.64%，海綿組織厚度增加25.62%～39.87%，表現(xiàn)出明顯的多倍體特征（表2）。

圖3 ‘紅脆甜’二倍體（CK）與四倍體（F38、F50、F51）植株葉片橫切面

表2 二倍體與四倍性植株葉片橫切面結(jié)構(gòu)特征差異

2.3 植株性狀差異分析

在同一溫室生長(zhǎng)環(huán)境和相同栽培管理?xiàng)l件下，同期定植的‘紅脆甜’二倍體和四倍體組培苗植株生長(zhǎng)量表現(xiàn)出明顯差異:二倍體植株生長(zhǎng)旺盛，株高達(dá)到2 m多，而四倍體植株則表現(xiàn)出明顯的矮化，同一發(fā)育時(shí)期株高還不足1 m，節(jié)間短縮，具有明顯的多倍體矮化特性（表3）。

表3 二倍體和四倍體兩年生植株性狀差異

3 討論與結(jié)論

紅果肉蘋(píng)果‘紅脆甜’經(jīng)染色體加倍后，顯微鏡單位視野內(nèi)葉片的表皮細(xì)胞和氣孔器體積均增大，密度明顯變小，因此，可將葉片表皮細(xì)胞和氣孔器密度的變化作為快速判斷染色體是否成功加倍的方法之一，用于大批量多倍體誘導(dǎo)再生植株的快速篩選。較之流式細(xì)胞儀和根尖染色體計(jì)數(shù)法，本試驗(yàn)所用鏡檢葉片表皮細(xì)胞和氣孔器密度變化的方法操作簡(jiǎn)單、取材方便，適用于對(duì)疑似加倍植株的大規(guī)模初篩。

葉片性狀與植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)及自我調(diào)控能力有關(guān)，葉片性狀如何響應(yīng)和適應(yīng)氣候變化是植物適應(yīng)性研究的重點(diǎn)內(nèi)容。有研究表明，葉片的柵欄組織是評(píng)價(jià)植物抗旱性的重要指標(biāo)之一［7，8］，上表皮 厚度是 評(píng)價(jià)抗 旱性的 代表性 指標(biāo)［9］，柵欄組織厚度和上表皮厚度是評(píng)價(jià)菊花抗寒性的重要指標(biāo)［10］。本研究葉片橫切解剖結(jié)構(gòu)顯示，成功加倍的‘紅脆甜’四倍體葉片上下表皮、柵欄組織、海綿組織等結(jié)構(gòu)的厚度均較二倍體顯著增加，這使得植株的抗寒性和抗旱性等抗逆性狀發(fā)生相應(yīng)變化。‘紅脆甜’四倍體的抗逆性評(píng)價(jià)也是下一步的研究目標(biāo)。

本研究一年生‘紅脆甜’四倍體和二倍體植株高度差異極顯著，四倍體植株表現(xiàn)出明顯的矮化特性，今后可以四倍體為砧木嫁接蘋(píng)果，研究其對(duì)接穗的影響及栽培效果，評(píng)價(jià)其作為蘋(píng)果矮化砧木的潛力和可行性，為蘋(píng)果矮化栽培集約化模式提供參考。