智力障礙/全面性發育遲緩遺傳學診斷策略探討

周有峰，黃 艷，劉光華

(1.福建省婦幼保健院兒科 福建醫科大學附屬醫院，福建 福州 350001; 2.福建醫科大學臨床醫學部，福建省婦幼保健院兒科，福建 福州 350001)

智力障礙/全面發育遲緩(intellectual disability/global developmental delay, ID/GDD)是兒童時期常見的神經發育障礙，是嚴重影響兒童健康的致殘性疾病。智力障礙這個術語通常應用于≥5歲的兒童[1]。全面發育遲緩專用于<5歲，在≥2個能區(大運動或精細運動、語言、認知、社交和社會適應能力等)沒有達到預期的發育標志，且無法接受系統性智力功能評估，包括年齡太小而無法參與標準化測試的兒童[2]。遺傳性因素在ID/GDD病因的占比約50%[3]。拷貝數變異(copy number variants, CNVs)是指染色體亞顯微結構中微重復和微缺失，與ID/GDD密切關聯[4]。約8%智力障礙患兒存在單核苷酸變異(single nucleotide variation ,SNV)[5]。CNV-seq是基于二代測序技術(next generation sequencing, NGS)的全基因組低深度測序方法，可檢測>100 kb CNVs，被認為是目前有望取代染色體微陣列(CMA)平臺的診斷技術[6-7]；全外顯子測序(whole exome sequencing, WES)可檢測基因內部SNV及小于10 bp的插入和缺失變異,理論上可與CNV-seq互為補充。基于以上理論，本研究根據預先設計的納入和排除標準，收集患兒資料,探討聯合檢測在ID/GDD遺傳學診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1研究對象 收集2016年6月至2019年12月就診于福建省婦幼保健院門診不明原因的智力障礙/全面發育遲緩患兒外周血樣本65例，男32例、女33例，年齡 3個月至5歲7個月，中位年齡7月。所有對象均簽署知情同意書。

1.2選擇標準 納入標準：(1)臨床表現為精神發育遲滯,經Gesell嬰幼兒發育量表評定DQ<75或韋氏智力量表評定IQ<70，符合美國精神病協會修訂的第5版診斷和統計學手冊(DSM-V)診斷標準；(2)無明確圍生期及生后缺氧、中毒、中樞神經系統感染及顱腦外傷史；(3)無明顯的顱腦影像學異常。排除標準：(1)生化、血氨、乳酸、血尿代謝篩查異常，考慮內分泌、遺傳代謝性疾病可能；(2)診斷為脆性X染色體綜合征。

1.3方法

1.3.1CNVs檢測 采集患兒及雙親血樣，提取DNA，構建基因組DNA文庫并進行全基因組文庫質控。采用Illumina NovaSeq 6000測序儀(美國 Illumina 公司)，應用CNV-seq檢測CNVs，采用2019年美國醫學遺傳學與基因組學學會(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)CNVs判讀推薦共識[8-9]，獲得陽性CNVs。

1.3.2SNV檢測 CNVs陰性患兒(包括可能良性、良性及陰性CNVs結果)，采用IDT公司的xGen? Exome Research Panel v1.0捕獲探針基礎上，設計并合成捕獲探針，與基因組DNA文庫序列進行液體雜交、DNA片段富集，采用Illumina NovaSeq 6000測序儀行三人家系全外顯子測序(trio-WES)。依據2015年ACMG單核苷酸變異的解讀指南[10-11]進行的SNV致病性分級和疾病關聯判定。

1.4統計學方法 采用SPSS 18.0軟件處理，采用χ2檢驗比較異常表型(包括面容異常、頭圍異常、器官畸形、癲癇等)差異。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1檢測結果分析 ID/GDD患兒65例共檢出29例陽性結果。22例CNVs陽性，其中致病性CNVs 15例，包括非綜合征或數據庫未定義的CNVs 2例；可能致病性CNVs 4例；臨床意義不明CNVs 3例。43例CNVs陰性樣本行trio-WES檢出7例與患兒表型關聯基因變異，見表1～2。

表1 22例陽性拷貝數變異分布特征和致病性

表2 7例家系全外顯子組測序陽性變異特征和關聯疾病

2.2陽性患兒表型差異分析 CNVs陽性組22例，單純ID/GDD4例，ID/GDD伴異常表型組18例；SNV陽性組7例，單純ID/GDD3例，ID/GDD伴異常表型4例。兩組患兒異常表型差異無統計學意義(P>0.05)，提示臨床難以通過表型確定遺傳變異類型，見表3。

表3 陽性患兒異常表型分析[例(%)]

2.3單獨檢測組與聯檢測組陽性率差異分析 兩種方法均陽性22例，單獨檢測陰性而聯合檢測陽性7例，兩種方法均陰性36例。采用McNemar檢驗比較兩種診斷方法陽性率差異有統計學意義(P<0.05)。提示聯合檢測較單獨檢測可提高陽性率, 見表4。

表4 兩種檢測方法陽性比較(例)

3 討 論

本研究通過基于NGS的CNV-seq和trio-WES檢測技術，發現29例ID/GDD患兒可能的遺傳病因，總體陽性率44.6%(29/65)，致病性CNVs檢出率23.1%。而CMA平臺檢測CNVs陽性率在15%～20%[12]。檢出率較高可能與以下因素相關：CNV-seq檢測基于高通量測序，均勻覆蓋全基因組，漏檢率低，而CMA芯片探針在基因組內密度并不均勻，可能導致漏檢。Dong等[13]在186個全血DNA樣本中，采用基于二代測序的CNVs檢測方法，檢測到62個致病CNVs，范圍從60.9 kb至41.7 mb，染色體異常檢出率達30.1%。在既往核型分析正常的樣本中，CNVs檢出率可達12.8%。與傳統CMA平臺比較，CNV-seq分辨率更高，可達50 kb。Gross等[14]研究發現， CNV-seq與CMA平臺的檢測同樣敏感，且可識別染色體嵌合三體。例1為染色體非整倍體重復，提示極端情況下，CNV-seq能檢測染色體非整倍體異常，且不需細胞培養，較核型分析有更高的檢測效率。未來改進算法后可能檢測50 bp至10 kb之間的小拷貝數變異和系統地檢測嵌合CNVs。此外，CNV-seq可以通過低至10 ng的基因組DNA來實現準確的CNV診斷，這比基于CMA的診斷所需的最低限度低20倍[15]。以上研究提示基于NGS的CNV-seq技術可以很好的彌補核型分析、CMA平臺的局限性，有助于提高檢測陽性率。

CNVs與SNV所致臨床表型無顯著性差異，難以通過臨床表型確定變異類型及最佳檢測方案。既往診斷流程建議對經代謝篩查、染色體核型分析、脆性X染色體檢測、CMA平臺檢測CNVs陰性的ID/GDD患兒可考慮NGS檢測[2]。流程需多次采血，診斷周期長。核型分析需細胞培養，陽性率僅為3%[16]，不利于早期診斷和家長依從。如果采用WES作為一線診斷測試，其診斷效能可能超過50%[17]。間隔6～12月后通過原始數據重分析，WES可能再增加約10%的診斷率[18]。采用CNV-seq與trio-WES聯合檢測方案，彌補了WES對CNVs診斷上的不足，可減少采血次數、縮短檢測周期。隨測序成本的下降，與CMA比較，采用CNV-seq與trio-WES聯合檢測方案可在檢測費用相似或稍高情況下大幅提高檢測陽性率；單臺設備檢測有效減少投入成本；同時父母驗證利于遺傳咨詢。本研究CNV-seq聯合trio-WES檢測陽性率較單獨CNV-seq檢測提升了10.8%。一項薈萃分析認為WES在診斷效能上明顯優于CMA，但與全基因組測序在診斷效能上無顯著差異[19]，考慮到成本因素， CNV-seq和trio-WES聯合檢測，檢測陽性率更高、周期較短、可重分析，可以很好地彌補核型分析、CMA平臺的局限，為進一步明確ID/GDD的遺傳學病因提供了新的方式，是現階段值得推廣的檢測策略。

CNV-seq亦存在不足，如無法檢測三倍體及多倍體，無法發現染色體平衡易位和單親二倍體，對基因組高度重復區域不敏感等[20]；WES無法發現內含子區域變異及三核苷酸重復序列異常[21]。目前基于NGS的短讀長基因組測序(short-read genome sequencing, srGS)可以檢測CNVs、倒位和平衡易位以及更復雜的結構變體和非編碼區域，預計將很快成為遺傳學檢測的新金標準[22]。未來結合基因組學、轉錄組學、蛋白組學及代謝組學的整體組學策略，將提供更多遺傳變異與臨床表型關聯證據，提高ID/GDD病因診斷率。