miR-944過表達對三陰乳腺癌細胞系MDA-MB-231的侵襲遷移和上皮間質轉化抑制作用及其機制

朱克鵬，肖勛蓉，羅義，尹均明，弋文，何英，宋遠鵬，杜果城

1川北醫學院附屬南充市中心醫院乳腺外科，四川南充637000；

2川北醫學院附屬南充市中心醫院康復科

三陰乳腺癌（TNBC）是乳腺癌常見的亞型，其雌、孕激素受體和人表皮生長因子受體表達均為陰性，占所有乳腺癌的15%～20%，并且具有惡性程度高，易侵襲、轉移的特點，預后較差［1］。盡管隨著外科手術、放化療技術的發展，乳腺癌的治療效果明顯提高，但乳腺癌術后復發轉移仍是患者死亡的主要原因［2］。相比于非TNBC，TNBC具有更高的復發及轉移率［3］。

微小RNA（miRNA）是一類近年發現的具有轉錄后調節功能的小分子單鏈RNA，在腫瘤的發生發展中發揮著重要調控作用［4］。miR-944是近期新發現的一個腫瘤相關的miRNA分子，其參與調控多種腫瘤細胞的增殖、凋亡和轉移［5-7］。目前miR-944在TNBC中的作用及機制尚不明確。2020年8月—2021年2月，我們觀察了miR-944在TNBC細胞系中的表達變化，探討了其對TNBC細胞侵襲、遷移能力和上皮間質轉化（EMT）的影響，并進一步探討了其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料人TNBC細胞系MDA-MB-231、MDAMB-453、HCC1806及正常乳腺上皮細胞系HBL-100均購自美國ATCC公司，培養于含10%胎牛血清和1%青霉素—鏈霉素溶液的細胞培養基，置于37℃、95%飽和濕度及5%CO2的恒溫環境中培養，細胞融合度達70%時，應用0.25%胰酶消化傳代。TRIzol試劑購自北京達科為生物公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購自大連寶生物公司；miR-944模擬物（miR-944 mimics）、陰性對照物（NC-mimics）及引物均購自上海吉瑪制藥公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Mgtrigel基質膠購自美國BD公司；Ecadherin、Vimentin、Fibronectin、GATA6及GAPDH抗體均購自美國CST公司。

1.2 人TNBC細胞系及正常乳腺上皮細胞系HBL-100中miR-944的檢測采用qRT-PCR法。應用TRIzol法提取細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書操作逆轉錄獲得cDNA，逆轉錄反應條件：16℃、30 min，45℃、30 min，85℃、5 min。取cDNA和PCR引物，按照qRT-PCR試劑盒說明書配制PCR反應體系及反應參數進行擴增反應，PCR反應條件：94℃、15 min，94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、30 s，共40個循環。miR-944引物序列：上游：5＇-AAATTATTGTA?CATCGGATGAG-3＇，下游：5＇-AAATTGTATAAAGA?GA AATT-3＇；U6引物序列：上游：5＇-CTCGCTTCG?GCAGCACA-3＇，下游：5＇-AACGCTTCACGAATTTGC?GT-3＇。以U6作為內參基因，應用2-ΔΔCt法計算miR-944的相對表達量。TNBC細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-453、HCC1806及正常乳腺上皮細胞系HBL-100中miR-944的相對表達量分別為0.23±0.10、0.51±0.11、0.60±0.09、0.96±0.06。與HBL-100細 胞 相 比，TNBC細 胞 系MDA-MB-231、MDA-MB-453、HCC1806中miR-944的相對表達量均降低（P均＜0.05）。選取miR-944相對表達量最低的MDA-MB-231細胞進行后續實驗。

1.3 MDA-MB-231細胞分組及miR-944轉染方法收集對數生長期的MDA-MB-231細胞接種于6孔板，將細胞分為2組，即陰性對照組（miR-944-NC組）和miR-944過表達組（miR-944-IN組），待細胞融合度達70%時按照Lipofectamine2000說明書操作，將NC-mimics轉染至miR-944-NC組細胞，將miR-944 mimics轉染至miR-944-IN組細胞，轉染后繼續置入37℃、95%飽和濕度及5% CO2的恒溫環境中培養48 h后進行后續實驗。

1.4 MDA-MB-231細胞miR-944的檢測采用qRT-PCR法。詳細步驟同1.2。

1.5 MDA-MB-231細胞遷移能力檢測采用細胞劃痕實驗。收集各組MDA-MB-231細胞，接種至6孔細胞板，細胞密度2×105個/孔，置入37℃、95%飽和濕度及5% CO2的恒溫環境中培養，待細胞鋪至90%后，使用100 μL移液槍頭垂直細胞板上制造“一”形劃痕，PBS沖洗細胞板3次后，繼續培養24 h。顯微鏡下觀察“一”形劃痕愈合情況，計算劃痕愈合率（%）表示細胞遷移能力。

1.6 MDA-MB-231細胞侵襲能力檢測采用Tran?swell侵襲實驗。從-20℃冰箱取出Mgtrigel基質膠，對Transwell小室底膜上室面進行均勻預鋪。收集各組MDA-MB-231細胞，無血清細胞培養基重懸各組細胞制作細胞懸液，細胞密度1×105/mL。各組取200 μL細胞懸液接種至Transwell小室上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的細胞培養基，置于37℃、95%飽和濕度及5% CO2的恒溫環境中培養48 h后取出Transwell小室，拭除小室上室面未穿膜的細胞后，以4%多聚甲醛固定細胞30 min，然后用0.1%結晶紫溶液染色10 min，應用顯微鏡觀察并拍照，隨機選擇6個不重復的視野計數細胞數目。

1.7 MDA-MB-231細胞中E-cadherin、Vimentin、Fi?bronectin、GATA6蛋白的檢測采用Western blot?ting法。收集各組MDA-MB-231細胞，應用細胞裂解液裂解，抽取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。按照每泳道30 μg蛋白樣品進行上樣，經100 g/L的SDS-PAGE電泳分離，電轉移至PVDF膜，洗膜后，將膜置于50 g/L的脫脂奶粉封閉液中封閉1 h，洗膜后置入稀釋的一抗E-cadherin（稀釋度1∶500）、Fibro?nectin（稀 釋 度1∶1 000）、Vimentin（稀 釋 度1∶1 000）、GATA6（稀釋度1∶1000）和GAPDH（稀釋度1∶1 000）溶液中繼續室溫孵育2 h，次日洗膜后置于稀釋的二抗（稀釋度1∶2 000）溶液中，室溫孵育1 h，加入ECL顯影液顯影。采用Quality One軟件計算各蛋白的相對表達量。

1.8 統計學方法采用SPSS20.0統計軟件。計量資料以-x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-944-IN組 和miR-944-NC組miR-944相 對表達量比較miR-944-IN組和miR-944-NC組MDAMB-231細胞中miR-944的相對表達量分別為4.23 ±0.23、1.02±0.03。與miR-944-NC組 相比，miR-944-IN組MDA-MB-231細 胞 中miR-944的相對表達量升高（P＜0.05），提示轉染效率較高，過表達miR-944的MDA-MB-231細胞構建成功。

2.2 miR-944-IN組 和miR-944-NC組MDA-MB-231細胞遷移、侵襲能力比較miR-944-NC組和miR-944-IN組MDA-MB-231細胞的劃痕愈合率分別為67.1%±5.8%、22.6%±3.2%。與miR-944-NC組相比，miR-944-IN組MDA-MB-231細胞劃痕愈合率降低（P＜0.05）。miR-944-IN組和miR-944-NC組穿膜細胞數量分別為（130±21）、（264±34）個。與miR-944-NC組相比，miR-944-IN組穿膜細胞數明顯減少（P＜0.05），見圖1。

圖1 兩組侵襲細胞顯微鏡下表現

2.3 miR-944-IN組和miR-944-NC組細胞中EMT相關標志物E-cadherin、Fibronectin、Vimentin蛋白及GATA6蛋白相對表達量比較與miR-944-NC組相比，miR-944-IN組細胞E-cadherin蛋白相對表達量升高（P＜0.05），Fibronectin、Vimentin蛋白相對表達量降低（P均＜0.05）。與miR-944-NC組相比，miR-944-IN組細胞中GATA6蛋白相對表達量降低（P＜0.05）。兩組EMT相關蛋白、GATA6蛋白相對表達量見表1。

表1 兩組EMT相關蛋白、GATA6蛋白相對表達量（±s）

表1 兩組EMT相關蛋白、GATA6蛋白相對表達量（±s）

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3 討論

乳腺癌是世界范圍內女性最常見的惡性腫瘤。據美國癌癥協會報道，乳腺癌占所有新發癌癥病例的30%，是女性癌癥相關性死亡的主要原因［8］。乳腺癌具有高度的異質性，為了進一步完善臨床診斷，根據雌、孕激素受體和人表皮生長因子受體表達的免疫組化特征，又將乳腺癌分為幾個分子亞型，包括Luminal A型乳腺癌、Luminal B型乳腺癌、HER-2陽性乳腺癌和TNBC，其中TNBC具有惡性程度高、發病年齡低、易轉移、復發率高、預后差的特點，目前仍缺乏有效的治療手段［9］。因此，開發探索一種新的靶向治療方法以提高TNBC的臨床療效具有重要意義。

miRNAs是非編碼的單鏈小分子RNA，含有約22個核苷酸，是靶基因的轉錄后調節因子。研究顯示，miRNAs在多種生物過程中發揮重要作用［10］。近年越來越多的證據表明，miRNAs參與了癌癥的發生及進展，作為癌基因或抑癌基因發揮重要的調控作用。miRNA在癌癥標志物及靶向治療方面的研究已經成為當前研究的熱點問題［11］。miR-944是新發現的腫瘤相關miRNA分子，與腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲有關［12］。研究顯示，miR-944能夠抑制鼻咽癌［13］、肺腺癌［14］、結直腸癌［15］、胃癌［16］等腫瘤細胞的生長及轉移，但在宮頸癌［17-18］、子宮內膜癌［19］、食管鱗癌［20］等腫瘤的研究中卻發現，miR-944作為癌基因起著促進腫瘤細胞生長轉移的作用，提示miR-944在不同的癌癥中具有高度異質性。至今，miR-944對TNBC細胞生長及轉移的影響和機制尚不清楚。本研究發現，miR-944在TNBC細胞系中的表達較正常乳腺上皮細胞系明顯降低，提示miR-944在TNBC中可能作為抑癌基因發揮作用。本研究通過轉染miR-944模擬物使得MDA-MB-231細胞中miR-944過表達，細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗結果顯示，過表達miR-944后的MDA-MB-231細胞遷移和侵襲能力均明顯降低，進一步證實miR-944能夠抑制TNBC細胞的侵襲和轉移。

研究顯示EMT是影響癌細胞侵襲遷移的關鍵性環節，逆轉腫瘤細胞EMT是抑制腫瘤侵襲轉移的重要策略［21］。本研究證實過表達miR-944的MDAMB-231細胞上皮細胞源性標志物E-cadherin蛋白的相對表達量顯著升高，間質細胞源性標志物Fibro?nectin、Vimentin等蛋白的相對表達量顯著降低，提示miR-944對TNBC細胞侵襲遷移能力的影響與其對EMT的調控有關。

GATA6屬GATA轉錄因子家族，具有高度保守的鋅指結構，能夠識別并結合GATA序列，在組織細胞的生長、發育及分化中均起著重要的作用［22］。目前較多研究發現，GATA6與多種腫瘤的發生發展有關，并且與腫瘤的EMT有關［23-24］。目前研究也已經證實，GATA6在乳腺癌組織和細胞中表達升高，并且促進乳腺癌細胞的生長、轉移及EMT［25-26］。研究顯示，GATA6作為miR-944的調控靶基因在惡性腫瘤的生長轉移及EMT的調控中發揮重要的作用［27-28］。本研究發現，過表達miR-944的MDA-MB-231細胞GATA6蛋白的相對表達量顯著降低，提示miR-944對TNBC細胞侵襲遷移及EMT的影響可能與其對GATA6的調控有關。

綜上所述，miR-944在TNBC細胞系中相對表達量降低。過表達miR-944能夠抑制TNBC細胞的遷移、侵襲及EMT，其機制可能與其對GATA6基因的調控有關，為TNBC的靶向治療提供了新的研究方向。本研究并沒有對miR-944在TNBC組織中表達進行檢測，有待進一步檢測miR-944在TNBC組織中表達情況，探討其表達與TNBC患者臨床病理特征的關系。