不同干燥程度草果果實形態及種仁揮發油的變化規律

許倬卉，楊紹兵，楊天梅，王元忠，張金渝*

(1.云南中醫藥大學 中藥學院，昆明 650500；2.云南省農業科學院藥用植物研究所，昆明 650200)

草果(AmomumtsaokoCrevost et Lemarie)屬于姜科豆蔻屬，生長在海拔1000～1300 m的陰蔽潮濕的環境中，主要分布于中國西南部以及越南北部；我國產量和種植面積最大的為云南省，該物種常作為扶貧經濟作物種植于適宜生長的偏遠山區[1]。根據調查發現，其鮮果香味清淡，使用率較低；干燥后的果實辛香氣味濃烈，耐儲存，日常用作調味品，被人們譽為食品調味中的“五香之一”、“王守義十三香”等系列產品均要用到，入藥則具有燥濕溫中、截瘧除痰的作用[2]。將其添加到肉制品中，既可治病又可增加肉類風味，降低油膩感，提升食用口感；芳香物質可防止肉品變質，延長保存時間，但干燥可能導致其含量與種類出現波動和變化，影響其作用[3]。

前人研究表明，該植物的主要化學成分有揮發油、黃酮、脂肪酸、二芳基庚烷、酚類等[4]。揮發油是一類次生代謝產物，當植物受到外界脅迫時，可抵御細菌的攻擊，保護植株正常生長[5]。草果的主要香氣成分來自分泌組織中揮發油單萜和倍半萜類化合物，單萜類主要包含萜烯及其衍生物(單萜醛、單萜醇等)，具有較強的香氣和活性，倍半萜類化合物具有抗炎抑菌作用，二者皆是醫藥、食品、化妝品的重要原料[6]。黃酮等化學成分具有抗氧化、抗陰道毛滴蟲、抗腫瘤和神經保護作用[7]。根據調查發現，干燥是防止新鮮果實霉變、腐爛、保證品質的關鍵一步。依據2020版《中國藥典》，草果以秋季成熟果實，曬干或低溫干燥入藥最佳[8]；在實際生產中，云南怒江地區常用熏烤的方式烘干草果，烘干時間較長，為8～10 d；臨滄和德宏地區則直接曬干，干燥時間為4～5 d，易受天氣的制約，如遇陰雨天氣，草果就會腐爛、長霉。陰干、55 ℃烘干、熏干、冷凍干燥4種處理的化學成分有差異，其中熏干的草果化學成分較為豐富和復雜，但對應化合物含量較低[9]。目前的文獻主要集中在草果完全干燥后揮發油的變化情況，其新鮮果實在干燥過程中揮發油含量和成分的變化未見系統報道[10-11]。中藥材在干燥過程中形態和有效成分均會發生改變[12]，草果的揮發油含量和成分在干燥過程中會出現怎樣的變化仍需進一步研究。

本研究選取安全可控的烘箱低溫(50 ℃)烘干法，分別測量0～48 h果實外觀形態，參照2020版《中國藥典》XD法提取并計算烘干過程中各時間段的揮發油得率，然后用氣相色譜-質譜法(GC-MS)鑒定不同時間段的揮發油化學成分，著重分析其成分在烘干過程中的變化規律，探究香味形成機理，為進一步研究草果采后加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗樣品于2019年11月采自云南省怒江州貢山縣獨龍江鄉，經云南省農業科學院藥用植物研究所張金渝研究員鑒定為草果(AmomumtsaokoCrevost et Lemarie)的新鮮果實。

1.2 方法

1.2.1 干燥

將洗凈的草果果實放入烘箱中，50 ℃低溫干燥。分別選取0，12，24，36，48 h 5個時間段的草果樣品，48 h樣品恒重，用于下一步實驗。

1.2.2 測量草果各時間段形態數據

選取具有代表的20個草果分別測量干燥0～48 h后的草果外觀形態，具體指標包括果重、果殼厚、果殼重、種子重。測量工具為游標卡尺，精度為0.01 mm;分析天平，精確度為0.01 g。

1.2.3 草果揮發油的提取

取0～48 h 5個時間段的草果種仁，粉碎至40目，精密稱取100 g，置于2000 mL的圓底燒瓶中，加8倍量水，參照2020年《中國藥典》揮發油測定甲法(通則2204)進行總揮發油的提取。提取完成之后加入無水硫酸鈉，密封，置于4 ℃冰箱中保存，并根據下式計算得油率(mL/g)：

1.3 GC-MS分析

Agilent 7890A GC型氣相色譜儀、Agilent 5975 MSD型質譜儀。色譜柱HP-5MS 5% 苯基甲基硅氧烷(0.25 mm×30 m×0.25 μm)。程序升溫40 ℃，保持1 min，以10 ℃/min的速率升至130 ℃，保持15 min，以5 ℃/min的速率升至260 ℃，保持15 min；載氣：He，流速1.0 mL/min；不分流，氣化溫度290 ℃；溶劑延遲5.00 min，電離方式：EI源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質量范圍(m/z)：50～600 amu，掃描速度2.11 s/dec。

1.4 數據處理與分析

利用標準數據庫NIST 11進行檢索匹配，取匹配率>90%的數據，當出現一個化合物的匹配率>90%的數據有多個的情況時，根據文獻進行比較，篩選一個最適宜的化合物。采用面積歸一法計算各個成分的相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 草果干燥過程中果實形態及揮發油得率的變化

草果果實烘干過程中果殼厚度變化見圖1，樣品在烘干過程中果殼越來越薄，其厚度在12～24 h之間下降最明顯。

圖1 草果干燥過程中果殼厚度的變化Fig.1 The changes of shell thickness during the drying process of A. tsaoko

由圖2可知，果實在未干燥之前，果殼質量比種仁重，隨著干燥過程的進行，果殼重量下降明顯，以12～24 h最為顯著，但種仁重量變化較為平緩。直至干燥結束時，種仁重量大于果殼重量。單個果實重量也呈現下降趨勢。綜合圖1和圖2，在干燥過程中，果殼厚度和果殼重量變化顯著，而種仁重量變化較小，說明草果果實中果殼水分含量較高。

圖2 草果單個果實、種仁、果殼重量在干燥過程中的變化Fig.2 The changes of the weight of fruit, seed kernel and shell during the drying process of A. tsaoko

草果果實質量在干燥過程中的變化見表1。

表1 草果果實質量在干燥過程中的變化Table 1 The changes of the weight of fruit during the drying process of A. tsaoko

樣品在干燥前期失重迅速，至烘干恒重時，失重率可高達66%。果實種仁得油率在干燥過程中逐漸增加，從鮮果的0.55% (mL/g)上升至36 h的1.25% (mL/g)，完全干燥(48 h)時得油率最高，為2.72% (mL/g)，符合藥典標準。結果表明，在干燥過程中，種仁得油率一直上升，其中36～48 h增加明顯，完全烘干時的揮發油得油率明顯高于鮮果樣品。干燥前處理使儲存揮發油的組織破裂，種仁中的揮發油得以釋放；加工干燥會激起植物的抗逆反應，刺激果壁外的酶產生大量的次生代謝成分，揮發油也會隨逆境脅迫而積累。上述內部結構破裂和逆境脅迫可能是導致草果種仁揮發油上升的主要原因，但揮發油沸點低，與空氣接觸后，揮發性物質可能會降低或消失，造成揮發油減少。

2.2 草果烘干過程中化學成分分析

采用GC-MS技術對草果烘干過程中化學成分進行分析，獲得總離子流，見圖3。

圖3 不同干燥時間草果種仁揮發油總離子流圖Fig.3 Total ionic chromatogram of volatile oil in A. tsaoko seed kernel at different drying time

比較GC-MS圖譜發現，保留時間在10～12 min時草果揮發油化學成分有明顯變化。為進一步分析草果種仁在干燥過程中的變化規律，通過NIST 11圖譜庫，并結合文獻報道的化合物，逐個鑒定檢測出的化合物，進行定性分析，用面積歸一法計算每個化合物的相對百分含量，見表2。

表2 草果果仁干燥種揮發性成分變化Table 2 The changes of volatile components in dried seeds of A. tsaoko seed kernel %

續 表

2.2.1 從草果中鑒定出的揮發性化合物

草果種仁中共鑒定出38種化合物，在0～48 h的5個時間段分別檢測出26，23，21，22，26種成分。主要包含烯烴類16種、醛類7種、芳香烴類3種、醚類1種、醇類11種。烯烴均為萜烯類化合物，具有相同的分子式C6H10，根據碳環的數目分為：鏈狀萜烯、單環單萜和雙環單萜烯。月桂烯和β-羅勒烯是最典型的鏈狀單萜烯，月桂烯具有辛香和胡椒的香味，β-羅勒烯則有清香、柑橘香味；單環單萜烯主要有D-檸檬烯、松油烯、γ-松油烯、α-水芹烯和β-菲蘭烯，是薄荷二烯中的雙鍵異構體；D-檸檬烯具有果香，松油烯和γ-松油烯常存在于一種揮發油中，具有柑橘的香味，α-水芹烯和β-菲蘭烯是兩種旋光異構體，具有柑橘、胡椒香氣；雙環單萜包含蒈烯、蒎烯、莰烯、側柏烯，是由薄荷烯在不同位置環化形成的，草果中蒈烯有(+)-3-蒈烯、2-蒈烯；蒎烯有左旋-α-蒎烯、(1R)-(+)-α蒎烯，α-蒎烯在空氣中容易氧化為樹脂狀物質；莰烯是唯一的結晶性萜烯；這些雙環單萜在一定條件下能發生重排，產生更多結構類型的化合物。萜烯可能隨著溫度增加，發生氧化反應脫氫成芳香族化合物，如鄰-異丙基苯，對-異丙基苯和2,3-二氫-1H-茚-4-甲醛[13]。

醛類化合物主要是由不飽和脂肪酸在脂肪氧化酶的催化氧化作用下形成的，是干草果中主要的香氣活性物質。(E)-2-辛烯醛帶有青葉香味，是一種稀少的合成香精，主要用于食品添加劑。α-檸檬醛是香葉醇的氧化產物，β-檸檬醛是香橙醇的氧化產物，此兩種單萜含氧衍生物常共存于同一揮發油中，可相互轉變，具有較廣的抑菌譜,是研制新型天然抗菌劑的重要原料[14]。

醇類化合物包括單萜醇類和倍半萜醇類。單萜醇類有萜品醇、香葉醇、芳樟醇，分子式均為C10H18O，都是同分異構體。萜品醇有α-松油醇及4-萜品醇，均含有手性碳，其單體分別為(+)-α-萜品醇、(-)-α-萜品醇、(+)-4-萜品醇、(R)-(-)-4-萜品醇，有丁香氣味。香葉醇具有玫瑰的香味，芳樟醇有木香和青香氣味，在外界環境發生變化時，會發生相互轉換，如香葉醇可轉化為芳樟醇，芳樟醇可變為α-松油醇；香葉醇部分氫化還原后得到D-香茅醇。倍半萜類有橙花叔醇、(E)-反橙花叔醇，常作為香調料。在烘干過程中香葉醇可能與外界空氣接觸，發生氧化反應，酯化形成乙酸香葉酯，上述醇類和酯類成分使草果果仁具有果香和花香氣息。1,8-桉葉素是一種醚類香氣活性化合物，它可由焦磷酸香葉醇酯在1,8-桉葉素環化酶的催化作用下生成，具有消炎和抗菌的作用[15]。

2.2.2 種仁揮發性成分在干燥過程中的變化

選取相對百分含量超過1%的化合物，分析其在干燥過程中的變化情況，見表2。在烘干過程中，草果揮發性化合物變化規律有以下幾個特點：(1)在烘干過程中，干燥程度不同導致某些化合物含量減少至無法檢測。如(1R)-(+)-α蒎烯在24 h和36 h的相對含量幾乎檢測不到，而在0，24，48 h可以檢測到其含量。(1S)-β-蒎烯、β-羅勒烯、左旋-α-蒎烯、β-蒎烯、α-檸檬醛、松油醇等化合物也出現類似現象。(2)某些化學成分的相對百分含量呈先上升后下降的趨勢。如1,8-桉葉素在烘干12 h的含量高于鮮樣，24～48 h含量逐漸下降，(E)-反-2-辛烯醛、香葉醇的含量變化也呈相似趨勢。(3)α-水芹烯的相對百分含量在12 h先增加，在24 h和36 h下降，48 h增至含量最高(4.71%)。(4)正新醛的相對百分含量變化基本保持不變，在鮮樣中占1.01%，12～36 h略有波動，48 h含量為0.95%，其含量基本保持不變。

草果中的揮發油主要是萜類和倍半萜類化合物，受溫度、光照和空氣的影響，這兩類化合物不耐熱、極易揮發。單萜類化合物可由一分子焦磷酸異戊烯醇酯(IPP)和一分子二磷酸3-甲基-2-丁烯醇酯(DMAPP)聚合形成C10化合物二磷酸香葉酯(GPP)，在植物酶的作用下可異構化為焦磷酸橙花酯(NPP)，進而轉化為各種單萜化合物，焦磷酸香葉酯(GPP)同一分子焦磷酸異戊烯酯聚合成焦磷酸麝子油脂(NPP)，從而形成倍半萜。據報道，當單萜類化合物接觸到空氣中的氧氣，含量會升高，氧氣被消耗時，其化合物結構可能發生重排；光照會使松油烯和月桂烯等降解或者發生分子內異構化；高溫會加速萜類化合物降解[16]。因此單萜類化合物如(E)-反-2-辛烯醛、1,8-桉葉素等，在干燥初期，接觸到氧氣時時含量會升高，在光照的影響下，其化合物含量下降；GC-MS過程中高溫加速其化合物降解或者轉變為其他同分異構體。此外，本次實驗中倍半萜化合物僅有橙花叔醇和(E)-反橙花叔醇，比前人報道的倍半萜少，推測可能是倍半萜類化合物長期暴露在高溫空氣中已降解為單萜類化合物[17]。

不同干燥程度的草果種仁化學成分與含量存在差異。干燥前后即使微小的含量變化也會影響香氣[18]，如1,8-桉葉素，鮮果中含量為37.43%，隨著干燥的進行，干果中的含量下降為34.25%，桉樹葉氣息下降，脂肪香氣強烈。干草果中的脂肪辛香氣息來自醛類化合物，在干燥過程中，由于萜醇的氧化，醛類化合物逐漸成為干草果中的主要香氣成分，就本實驗結果而言，雖然含量有略微下降的趨勢，但通過烘干處理、儲存過程中與空氣的接觸，溫度、水分、氧化等多方面因素導致其醛類化合物慢慢增加，辛香氣味愈發濃烈[19]。

3 結論

調料的質量與產地、采收期有關，但干燥才是保證品質最重要的一步。由于草果的果實含水量較高，為防止其在儲存過程中霉變和回潮，探明干燥過程中化學成分變化顯得格外重要。本文從果實外觀形態、種仁揮發油得率及其揮發油化學成分差異方面分析草果果實在干燥過程中的變化規律。結果表明，在烘干過程中，種仁的揮發油得油率逐漸上升，烘干至48 h恒重時，揮發油得率最高(2.72%, mL/g)。根據鑒定和分析，1,8-桉葉素、醛類化合物相對含量占比較高，為主要的香氣成分，此外，其余含量較低的成分也不可忽略，如單萜類、倍半萜類化合物含量雖然偏低，但與主要香氣成分相互作用、相互補充，構成草果的獨特香味。不同干燥程度下，上述化合物含量發生變化，導致香氣有所差異。種仁中的醛類物質是肉類香氣的重要組成部分，可由其前體物在干燥中氧化形成，達到增香提味的作用；單萜類化合物受溫度、光照、空氣等因素的影響會發生重排或降解，這提示在干燥、存儲和提取揮發油時需要考慮外界因素的影響。

綜上所述，草果在干燥過程中揮發油含量增高，同時其化合物也會在此過程中發生氧化、重排或降解。為確保其香味，應將草果干燥至恒重，避免回潮，影響使用。除低溫烘干過程中的化學成分變化，不同干燥方式(熏干、凍干、曬干)的化學成分及形態的動態變化規律仍需要進一步探索。此外，其揮發油在儲存過程中的溫度、光照、水分也會引起其香氣成分的變化，有關草果精油儲藏條件和方式有待更深入研究。