不同干燥程度草果果實(shí)形態(tài)及種仁揮發(fā)油的變化規(guī)律

許倬卉，楊紹兵，楊天梅，王元忠，張金渝*

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，昆明 650500；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，昆明 650200)

草果(AmomumtsaokoCrevost et Lemarie)屬于姜科豆蔻屬，生長在海拔1000～1300 m的陰蔽潮濕的環(huán)境中，主要分布于中國西南部以及越南北部；我國產(chǎn)量和種植面積最大的為云南省，該物種常作為扶貧經(jīng)濟(jì)作物種植于適宜生長的偏遠(yuǎn)山區(qū)[1]。根據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其鮮果香味清淡，使用率較低；干燥后的果實(shí)辛香氣味濃烈，耐儲(chǔ)存，日常用作調(diào)味品，被人們譽(yù)為食品調(diào)味中的“五香之一”、“王守義十三香”等系列產(chǎn)品均要用到，入藥則具有燥濕溫中、截瘧除痰的作用[2]。將其添加到肉制品中，既可治病又可增加肉類風(fēng)味，降低油膩感，提升食用口感；芳香物質(zhì)可防止肉品變質(zhì)，延長保存時(shí)間，但干燥可能導(dǎo)致其含量與種類出現(xiàn)波動(dòng)和變化，影響其作用[3]。

前人研究表明，該植物的主要化學(xué)成分有揮發(fā)油、黃酮、脂肪酸、二芳基庚烷、酚類等[4]。揮發(fā)油是一類次生代謝產(chǎn)物，當(dāng)植物受到外界脅迫時(shí)，可抵御細(xì)菌的攻擊，保護(hù)植株正常生長[5]。草果的主要香氣成分來自分泌組織中揮發(fā)油單萜和倍半萜類化合物，單萜類主要包含萜烯及其衍生物(單萜醛、單萜醇等)，具有較強(qiáng)的香氣和活性，倍半萜類化合物具有抗炎抑菌作用，二者皆是醫(yī)藥、食品、化妝品的重要原料[6]。黃酮等化學(xué)成分具有抗氧化、抗陰道毛滴蟲、抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)作用[7]。根據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，干燥是防止新鮮果實(shí)霉變、腐爛、保證品質(zhì)的關(guān)鍵一步。依據(jù)2020版《中國藥典》，草果以秋季成熟果實(shí)，曬干或低溫干燥入藥最佳[8]；在實(shí)際生產(chǎn)中，云南怒江地區(qū)常用熏烤的方式烘干草果，烘干時(shí)間較長，為8～10 d；臨滄和德宏地區(qū)則直接曬干，干燥時(shí)間為4～5 d，易受天氣的制約，如遇陰雨天氣，草果就會(huì)腐爛、長霉。陰干、55 ℃烘干、熏干、冷凍干燥4種處理的化學(xué)成分有差異，其中熏干的草果化學(xué)成分較為豐富和復(fù)雜，但對應(yīng)化合物含量較低[9]。目前的文獻(xiàn)主要集中在草果完全干燥后揮發(fā)油的變化情況，其新鮮果實(shí)在干燥過程中揮發(fā)油含量和成分的變化未見系統(tǒng)報(bào)道[10-11]。中藥材在干燥過程中形態(tài)和有效成分均會(huì)發(fā)生改變[12]，草果的揮發(fā)油含量和成分在干燥過程中會(huì)出現(xiàn)怎樣的變化仍需進(jìn)一步研究。

本研究選取安全可控的烘箱低溫(50 ℃)烘干法，分別測量0～48 h果實(shí)外觀形態(tài)，參照2020版《中國藥典》XD法提取并計(jì)算烘干過程中各時(shí)間段的揮發(fā)油得率，然后用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)鑒定不同時(shí)間段的揮發(fā)油化學(xué)成分，著重分析其成分在烘干過程中的變化規(guī)律，探究香味形成機(jī)理，為進(jìn)一步研究草果采后加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)樣品于2019年11月采自云南省怒江州貢山縣獨(dú)龍江鄉(xiāng)，經(jīng)云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所張金渝研究員鑒定為草果(AmomumtsaokoCrevost et Lemarie)的新鮮果實(shí)。

1.2 方法

1.2.1 干燥

將洗凈的草果果實(shí)放入烘箱中，50 ℃低溫干燥。分別選取0，12，24，36，48 h 5個(gè)時(shí)間段的草果樣品，48 h樣品恒重，用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 測量草果各時(shí)間段形態(tài)數(shù)據(jù)

選取具有代表的20個(gè)草果分別測量干燥0～48 h后的草果外觀形態(tài)，具體指標(biāo)包括果重、果殼厚、果殼重、種子重。測量工具為游標(biāo)卡尺，精度為0.01 mm;分析天平，精確度為0.01 g。

1.2.3 草果揮發(fā)油的提取

取0～48 h 5個(gè)時(shí)間段的草果種仁，粉碎至40目，精密稱取100 g，置于2000 mL的圓底燒瓶中，加8倍量水，參照2020年《中國藥典》揮發(fā)油測定甲法(通則2204)進(jìn)行總揮發(fā)油的提取。提取完成之后加入無水硫酸鈉，密封，置于4 ℃冰箱中保存，并根據(jù)下式計(jì)算得油率(mL/g)：

1.3 GC-MS分析

Agilent 7890A GC型氣相色譜儀、Agilent 5975 MSD型質(zhì)譜儀。色譜柱HP-5MS 5% 苯基甲基硅氧烷(0.25 mm×30 m×0.25 μm)。程序升溫40 ℃，保持1 min，以10 ℃/min的速率升至130 ℃，保持15 min，以5 ℃/min的速率升至260 ℃，保持15 min；載氣：He，流速1.0 mL/min；不分流，氣化溫度290 ℃；溶劑延遲5.00 min，電離方式：EI源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量范圍(m/z)：50～600 amu，掃描速度2.11 s/dec。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫NIST 11進(jìn)行檢索匹配，取匹配率>90%的數(shù)據(jù)，當(dāng)出現(xiàn)一個(gè)化合物的匹配率>90%的數(shù)據(jù)有多個(gè)的情況時(shí)，根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行比較，篩選一個(gè)最適宜的化合物。采用面積歸一法計(jì)算各個(gè)成分的相對百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 草果干燥過程中果實(shí)形態(tài)及揮發(fā)油得率的變化

草果果實(shí)烘干過程中果殼厚度變化見圖1，樣品在烘干過程中果殼越來越薄，其厚度在12～24 h之間下降最明顯。

圖1 草果干燥過程中果殼厚度的變化Fig.1 The changes of shell thickness during the drying process of A. tsaoko

由圖2可知，果實(shí)在未干燥之前，果殼質(zhì)量比種仁重，隨著干燥過程的進(jìn)行，果殼重量下降明顯，以12～24 h最為顯著，但種仁重量變化較為平緩。直至干燥結(jié)束時(shí)，種仁重量大于果殼重量。單個(gè)果實(shí)重量也呈現(xiàn)下降趨勢。綜合圖1和圖2，在干燥過程中，果殼厚度和果殼重量變化顯著，而種仁重量變化較小，說明草果果實(shí)中果殼水分含量較高。

圖2 草果單個(gè)果實(shí)、種仁、果殼重量在干燥過程中的變化Fig.2 The changes of the weight of fruit, seed kernel and shell during the drying process of A. tsaoko

草果果實(shí)質(zhì)量在干燥過程中的變化見表1。

表1 草果果實(shí)質(zhì)量在干燥過程中的變化Table 1 The changes of the weight of fruit during the drying process of A. tsaoko

樣品在干燥前期失重迅速，至烘干恒重時(shí)，失重率可高達(dá)66%。果實(shí)種仁得油率在干燥過程中逐漸增加，從鮮果的0.55% (mL/g)上升至36 h的1.25% (mL/g)，完全干燥(48 h)時(shí)得油率最高，為2.72% (mL/g)，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，在干燥過程中，種仁得油率一直上升，其中36～48 h增加明顯，完全烘干時(shí)的揮發(fā)油得油率明顯高于鮮果樣品。干燥前處理使儲(chǔ)存揮發(fā)油的組織破裂，種仁中的揮發(fā)油得以釋放；加工干燥會(huì)激起植物的抗逆反應(yīng)，刺激果壁外的酶產(chǎn)生大量的次生代謝成分，揮發(fā)油也會(huì)隨逆境脅迫而積累。上述內(nèi)部結(jié)構(gòu)破裂和逆境脅迫可能是導(dǎo)致草果種仁揮發(fā)油上升的主要原因，但揮發(fā)油沸點(diǎn)低，與空氣接觸后，揮發(fā)性物質(zhì)可能會(huì)降低或消失，造成揮發(fā)油減少。

2.2 草果烘干過程中化學(xué)成分分析

采用GC-MS技術(shù)對草果烘干過程中化學(xué)成分進(jìn)行分析，獲得總離子流，見圖3。

圖3 不同干燥時(shí)間草果種仁揮發(fā)油總離子流圖Fig.3 Total ionic chromatogram of volatile oil in A. tsaoko seed kernel at different drying time

比較GC-MS圖譜發(fā)現(xiàn)，保留時(shí)間在10～12 min時(shí)草果揮發(fā)油化學(xué)成分有明顯變化。為進(jìn)一步分析草果種仁在干燥過程中的變化規(guī)律，通過NIST 11圖譜庫，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的化合物，逐個(gè)鑒定檢測出的化合物，進(jìn)行定性分析，用面積歸一法計(jì)算每個(gè)化合物的相對百分含量，見表2。

表2 草果果仁干燥種揮發(fā)性成分變化Table 2 The changes of volatile components in dried seeds of A. tsaoko seed kernel %

續(xù) 表

2.2.1 從草果中鑒定出的揮發(fā)性化合物

草果種仁中共鑒定出38種化合物，在0～48 h的5個(gè)時(shí)間段分別檢測出26，23，21，22，26種成分。主要包含烯烴類16種、醛類7種、芳香烴類3種、醚類1種、醇類11種。烯烴均為萜烯類化合物，具有相同的分子式C6H10，根據(jù)碳環(huán)的數(shù)目分為：鏈狀萜烯、單環(huán)單萜和雙環(huán)單萜烯。月桂烯和β-羅勒烯是最典型的鏈狀單萜烯，月桂烯具有辛香和胡椒的香味，β-羅勒烯則有清香、柑橘香味；單環(huán)單萜烯主要有D-檸檬烯、松油烯、γ-松油烯、α-水芹烯和β-菲蘭烯，是薄荷二烯中的雙鍵異構(gòu)體；D-檸檬烯具有果香，松油烯和γ-松油烯常存在于一種揮發(fā)油中，具有柑橘的香味，α-水芹烯和β-菲蘭烯是兩種旋光異構(gòu)體，具有柑橘、胡椒香氣；雙環(huán)單萜包含蒈烯、蒎烯、莰烯、側(cè)柏烯，是由薄荷烯在不同位置環(huán)化形成的，草果中蒈烯有(+)-3-蒈烯、2-蒈烯；蒎烯有左旋-α-蒎烯、(1R)-(+)-α蒎烯，α-蒎烯在空氣中容易氧化為樹脂狀物質(zhì)；莰烯是唯一的結(jié)晶性萜烯；這些雙環(huán)單萜在一定條件下能發(fā)生重排，產(chǎn)生更多結(jié)構(gòu)類型的化合物。萜烯可能隨著溫度增加，發(fā)生氧化反應(yīng)脫氫成芳香族化合物，如鄰-異丙基苯，對-異丙基苯和2,3-二氫-1H-茚-4-甲醛[13]。

醛類化合物主要是由不飽和脂肪酸在脂肪氧化酶的催化氧化作用下形成的，是干草果中主要的香氣活性物質(zhì)。(E)-2-辛烯醛帶有青葉香味，是一種稀少的合成香精，主要用于食品添加劑。α-檸檬醛是香葉醇的氧化產(chǎn)物，β-檸檬醛是香橙醇的氧化產(chǎn)物，此兩種單萜含氧衍生物常共存于同一揮發(fā)油中，可相互轉(zhuǎn)變，具有較廣的抑菌譜,是研制新型天然抗菌劑的重要原料[14]。

醇類化合物包括單萜醇類和倍半萜醇類。單萜醇類有萜品醇、香葉醇、芳樟醇，分子式均為C10H18O，都是同分異構(gòu)體。萜品醇有α-松油醇及4-萜品醇，均含有手性碳，其單體分別為(+)-α-萜品醇、(-)-α-萜品醇、(+)-4-萜品醇、(R)-(-)-4-萜品醇，有丁香氣味。香葉醇具有玫瑰的香味，芳樟醇有木香和青香氣味，在外界環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，會(huì)發(fā)生相互轉(zhuǎn)換，如香葉醇可轉(zhuǎn)化為芳樟醇，芳樟醇可變?yōu)棣?松油醇；香葉醇部分氫化還原后得到D-香茅醇。倍半萜類有橙花叔醇、(E)-反橙花叔醇，常作為香調(diào)料。在烘干過程中香葉醇可能與外界空氣接觸，發(fā)生氧化反應(yīng)，酯化形成乙酸香葉酯，上述醇類和酯類成分使草果果仁具有果香和花香氣息。1,8-桉葉素是一種醚類香氣活性化合物，它可由焦磷酸香葉醇酯在1,8-桉葉素環(huán)化酶的催化作用下生成，具有消炎和抗菌的作用[15]。

2.2.2 種仁揮發(fā)性成分在干燥過程中的變化

選取相對百分含量超過1%的化合物，分析其在干燥過程中的變化情況，見表2。在烘干過程中，草果揮發(fā)性化合物變化規(guī)律有以下幾個(gè)特點(diǎn)：(1)在烘干過程中，干燥程度不同導(dǎo)致某些化合物含量減少至無法檢測。如(1R)-(+)-α蒎烯在24 h和36 h的相對含量幾乎檢測不到，而在0，24，48 h可以檢測到其含量。(1S)-β-蒎烯、β-羅勒烯、左旋-α-蒎烯、β-蒎烯、α-檸檬醛、松油醇等化合物也出現(xiàn)類似現(xiàn)象。(2)某些化學(xué)成分的相對百分含量呈先上升后下降的趨勢。如1,8-桉葉素在烘干12 h的含量高于鮮樣，24～48 h含量逐漸下降，(E)-反-2-辛烯醛、香葉醇的含量變化也呈相似趨勢。(3)α-水芹烯的相對百分含量在12 h先增加，在24 h和36 h下降，48 h增至含量最高(4.71%)。(4)正新醛的相對百分含量變化基本保持不變，在鮮樣中占1.01%，12～36 h略有波動(dòng)，48 h含量為0.95%，其含量基本保持不變。

草果中的揮發(fā)油主要是萜類和倍半萜類化合物，受溫度、光照和空氣的影響，這兩類化合物不耐熱、極易揮發(fā)。單萜類化合物可由一分子焦磷酸異戊烯醇酯(IPP)和一分子二磷酸3-甲基-2-丁烯醇酯(DMAPP)聚合形成C10化合物二磷酸香葉酯(GPP)，在植物酶的作用下可異構(gòu)化為焦磷酸橙花酯(NPP)，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為各種單萜化合物，焦磷酸香葉酯(GPP)同一分子焦磷酸異戊烯酯聚合成焦磷酸麝子油脂(NPP)，從而形成倍半萜。據(jù)報(bào)道，當(dāng)單萜類化合物接觸到空氣中的氧氣，含量會(huì)升高，氧氣被消耗時(shí)，其化合物結(jié)構(gòu)可能發(fā)生重排；光照會(huì)使松油烯和月桂烯等降解或者發(fā)生分子內(nèi)異構(gòu)化；高溫會(huì)加速萜類化合物降解[16]。因此單萜類化合物如(E)-反-2-辛烯醛、1,8-桉葉素等，在干燥初期，接觸到氧氣時(shí)時(shí)含量會(huì)升高，在光照的影響下，其化合物含量下降；GC-MS過程中高溫加速其化合物降解或者轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌之悩?gòu)體。此外，本次實(shí)驗(yàn)中倍半萜化合物僅有橙花叔醇和(E)-反橙花叔醇，比前人報(bào)道的倍半萜少，推測可能是倍半萜類化合物長期暴露在高溫空氣中已降解為單萜類化合物[17]。

不同干燥程度的草果種仁化學(xué)成分與含量存在差異。干燥前后即使微小的含量變化也會(huì)影響香氣[18]，如1,8-桉葉素，鮮果中含量為37.43%，隨著干燥的進(jìn)行，干果中的含量下降為34.25%，桉樹葉氣息下降，脂肪香氣強(qiáng)烈。干草果中的脂肪辛香氣息來自醛類化合物，在干燥過程中，由于萜醇的氧化，醛類化合物逐漸成為干草果中的主要香氣成分，就本實(shí)驗(yàn)結(jié)果而言，雖然含量有略微下降的趨勢，但通過烘干處理、儲(chǔ)存過程中與空氣的接觸，溫度、水分、氧化等多方面因素導(dǎo)致其醛類化合物慢慢增加，辛香氣味愈發(fā)濃烈[19]。

3 結(jié)論

調(diào)料的質(zhì)量與產(chǎn)地、采收期有關(guān)，但干燥才是保證品質(zhì)最重要的一步。由于草果的果實(shí)含水量較高，為防止其在儲(chǔ)存過程中霉變和回潮，探明干燥過程中化學(xué)成分變化顯得格外重要。本文從果實(shí)外觀形態(tài)、種仁揮發(fā)油得率及其揮發(fā)油化學(xué)成分差異方面分析草果果實(shí)在干燥過程中的變化規(guī)律。結(jié)果表明，在烘干過程中，種仁的揮發(fā)油得油率逐漸上升，烘干至48 h恒重時(shí)，揮發(fā)油得率最高(2.72%, mL/g)。根據(jù)鑒定和分析，1,8-桉葉素、醛類化合物相對含量占比較高，為主要的香氣成分，此外，其余含量較低的成分也不可忽略，如單萜類、倍半萜類化合物含量雖然偏低，但與主要香氣成分相互作用、相互補(bǔ)充，構(gòu)成草果的獨(dú)特香味。不同干燥程度下，上述化合物含量發(fā)生變化，導(dǎo)致香氣有所差異。種仁中的醛類物質(zhì)是肉類香氣的重要組成部分，可由其前體物在干燥中氧化形成，達(dá)到增香提味的作用；單萜類化合物受溫度、光照、空氣等因素的影響會(huì)發(fā)生重排或降解，這提示在干燥、存儲(chǔ)和提取揮發(fā)油時(shí)需要考慮外界因素的影響。

綜上所述，草果在干燥過程中揮發(fā)油含量增高，同時(shí)其化合物也會(huì)在此過程中發(fā)生氧化、重排或降解。為確保其香味，應(yīng)將草果干燥至恒重，避免回潮，影響使用。除低溫烘干過程中的化學(xué)成分變化，不同干燥方式(熏干、凍干、曬干)的化學(xué)成分及形態(tài)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律仍需要進(jìn)一步探索。此外，其揮發(fā)油在儲(chǔ)存過程中的溫度、光照、水分也會(huì)引起其香氣成分的變化，有關(guān)草果精油儲(chǔ)藏條件和方式有待更深入研究。