天蠶素抗菌肽(Cecropin A)融合蛋白的表達(dá)及其分離純化工藝研究

何成霞，鄒強，劉達(dá)玉，茍興華，陶雪菊，詹茂，黃海韜

(成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，成都 610106)

真菌、細(xì)菌等的污染已成為危害食品安全的一個重要問題，研究表明來源于動植物中的活性成分能夠抑制食品中病菌的生長繁殖[1]，其中最早發(fā)現(xiàn)于惜古比天蠶中的天蠶素抗菌肽(Cecropin)[2]是研究熱點之一，Cecropin在宿主防御系統(tǒng)中起著非常重要的作用[3]，其結(jié)構(gòu)特殊能快速滲透細(xì)胞膜，破壞、裂解細(xì)菌從而達(dá)到抗菌目的[4-5]。研究顯示，Cecropin具有較強的抑菌活性，在食品防腐添加劑工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用價值，康蘇等[6]在番茄汁、葡萄汁中添加Cecropin XJ，結(jié)果顯示其能有效抑制果汁中致病菌生長，Maya Fitriyanti等[7]利用超聲波細(xì)胞粉碎技術(shù)與Cecropin P1聯(lián)合使用，對牛奶、橙汁等進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)超聲波聯(lián)合Cecropin P1使用對牛奶和橙汁中的大腸桿菌具有明顯的抑制作用，趙國萍等[8]認(rèn)為柞蠶抗菌肽在酸性條件下的抗菌活性更強，適用于酸性食品防腐。

天然的食品防腐劑是未來食品防腐工業(yè)的發(fā)展方向[9]，但是從自然中提取抗菌肽耗時長、效率低，而化學(xué)合成成本較高[10]，這些都阻礙著抗菌肽的發(fā)展，隨著基因工程技術(shù)的應(yīng)用，越來越多的研究者利用該技術(shù)生產(chǎn)出具有高活性、高表達(dá)量的抗菌肽，因此利用基因工程技術(shù)表達(dá)Cecropin融合蛋白，是提高其表達(dá)水平，降低其生產(chǎn)成本的有效途徑。本研究通過對Cecropin A融合蛋白的表達(dá)條件、純化方法進(jìn)行優(yōu)化，包括測試種子菌接種濃度、誘導(dǎo)時間、溫度及培養(yǎng)基pH等因素對表達(dá)的影響以獲取最佳表達(dá)條件，采用親和層析方法分離純化Cecropin A融合蛋白，這些為提高Cecropin A融合蛋白的表達(dá)水平及純化效果、降低其生產(chǎn)成本奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-CA:由本實驗室構(gòu)建；大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)BL21:由本實驗室保存；LB液體培養(yǎng)基；ZYM-5052液體培養(yǎng)基；Ampicillin:購自上海捷瑞生物工程有限公司。

ZYM-5052液體培養(yǎng)基[11]及緩沖液的配制方法如下：

50×5052培養(yǎng)基：取25 g甘油，加水稀釋，加入2.5 g葡萄糖溶解，再加入10 g乳糖溶解后純化水定容至100 mL 。

50×M試液：取17.75 g磷酸氫二鈉(含12個結(jié)晶水)用純化水溶解后，加入17 g磷酸二氫鉀溶解，然后加入13.4 g氯化銨溶解，最后加入3.55 g硫酸鈉溶解，用純化水定容至100 mL。

1% ZY培養(yǎng)基：取2 g胰蛋白胨、1.0 g酵母提取物加純化水溶解并定容至100 mL。

MgSO4試液(0.1 mol/L)：取2.465 g的MgSO4·7H2O加純化水溶解并定容至100 mL。

1000×微量金屬：稱取0.222 g CaCl2、0.012 g H3BO3、0.288 g ZnSO4、0.198 g MnCl2、0.0484 g NaMoO4、0.047 g NiCl2、加純化水混勻并定容至50 mL。

ZYM-5052：量取2 mL 50×M試液、2 mL 50×5052培養(yǎng)基、2 mL MgSO4試液(0.1 mol/L)、20 μL 1000×微量金屬、50 mL 1% ZY培養(yǎng)基，用純化水溶解并定容至100 mL，121 ℃，高壓滅菌20 min。

20 mmol/L PB緩沖液，pH 7.2：稱取2.58 g Na2HPO4·12H2O、0.44 g NaH2PO4·2H2O加純化水溶解并定容至500 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16G臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；ZQTY-70S臺式溫控?fù)u床 上海知楚儀器有限公司；DYCZ-25D電泳槽 北京六一生物科技有限公司；超聲波細(xì)胞破碎機；His Trap螯合柱；AKTA蛋白純化儀。

1.3 方法

1.3.1 基因工程菌種子菌制備

取重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-CA轉(zhuǎn)化E.coli(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂LB平板(含終濃度為0.1 mg/mL的氨芐青霉素)，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取單菌落接種至新鮮的LB液體培養(yǎng)基(含終濃度為0.1 mg/mL的氨芐青霉素)中，37 ℃，150 r/min培養(yǎng)過夜，獲得Cecropin A種子菌。將種子菌保存于甘油管中，-20 ℃凍存。每次誘導(dǎo)前取甘油菌接種至新鮮的LB液體培養(yǎng)基(含終濃度為0.1 mg/mL的氨芐青霉素)中，37 ℃，150 r/min培養(yǎng)過夜，活化種子菌。

1.3.2 種子菌接種量對表達(dá)量的影響

例如，在《小英雄雨來》一課教學(xué)中，課外詳細(xì)描述了抗日戰(zhàn)爭中我國人民的智慧以及勇敢精神，是培養(yǎng)學(xué)生逐漸形成堅定不移、寧死不屈精神的重要途徑，通過教材內(nèi)容深入挖掘?qū)τ诟咝鋵崘蹏髁x思想教育具有重要意義[2]。因此，結(jié)合教學(xué)內(nèi)容以及小學(xué)生的理解能力等特點，小學(xué)語文教師在實際展開這一課教學(xué)時，可以帶領(lǐng)班級學(xué)生參觀當(dāng)?shù)夭┪镳^以及紀(jì)念館等，促使學(xué)生從多個角度出發(fā)深刻感受家鄉(xiāng)的優(yōu)秀傳統(tǒng)文化，在傳統(tǒng)傳統(tǒng)文化以及中華民族精神的過程中，實現(xiàn)對小學(xué)生傳統(tǒng)文化素養(yǎng)以及綜合素質(zhì)的全面培養(yǎng)。

取活化后的種子菌按照濃度分別為：1.0%、1.5%、2.0%、2.5%加至pH 6.5的 ZYM-5052(含終濃度為0.1 mg/mL氨芐青霉素溶液)液體培養(yǎng)基中，于37 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)，誘導(dǎo)7 h后停止培養(yǎng)，每個因素做3個平行樣，SDS-PAGE凝膠電泳檢測對應(yīng)條件下的融合蛋白表達(dá)量，獲得最佳種子接種量。

1.3.3 誘導(dǎo)時間對表達(dá)量的影響

取活化后的種子菌按照2.0%的濃度加至ZYM-5052(含終濃度為0.1 mg/mL氨芐青霉素溶液)液體培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)，從誘導(dǎo)1 h開始每隔1 h取樣，將取出的菌體濃度稀釋10倍后，以同批次ZYM-5052液體培養(yǎng)基為空白，于600 nm處測定吸光度，并于誘導(dǎo)12 h后停止培養(yǎng)，SDS-PAGE凝膠電泳檢測各時間點的融合蛋白表達(dá)量。

1.3.4 誘導(dǎo)溫度對融合蛋白表達(dá)量的影響

取活化后的種子菌按照2.0%的濃度加至pH 6.5的 ZYM-5052(含終濃度為0.1 mg/mL氨芐青霉素溶液)液體培養(yǎng)基中，于25，28，31，35，37 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)，誘導(dǎo)10 h后停止培養(yǎng)，每個因素做3個平行樣，SDS-PAGE凝膠電泳檢測各溫度條件下的融合蛋白表達(dá)量，獲得最佳誘導(dǎo)溫度。

1.3.5 pH值對表達(dá)量的影響

1.3.6 擴大培養(yǎng)

取5 L錐形瓶加入2000 mL ZYM-5052(含終濃度為0.1 mg/mL氨芐青霉素)液體培養(yǎng)基中，按照最優(yōu)條件，即培養(yǎng)基pH 6.5，培養(yǎng)溫度31 ℃，種子菌濃度2.0%，誘導(dǎo)時間10 h，150 r/min搖床培養(yǎng)，SDS-PAGE凝膠電泳檢測其表達(dá)量，并稱取濕菌體重量。

1.3.7 包涵體處理

將自誘導(dǎo)的菌液分別轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，離心收集菌體，按照1∶10 (g/mL)加入PBS Buffer重懸菌體并重復(fù)以上步驟，于冰浴中超聲破菌，超聲功率200 W，破碎20 min，離心收集菌體及上清。取包涵體按照1∶10 (g/mL)加入洗滌液(含2 mol/L尿素溶液，0.5% Triton X-100，20 mmol/L PB Buffer，pH 7.2)攪拌洗滌0.5 h，10000 r/min離心20 min后，輕輕棄掉部分上清后繼續(xù)以10000 r/min離心20 min收集包涵體，再按照1∶10 (g/mL)加入PBS Buffer pH 7.4進(jìn)行重懸，8000 r/min離心10 min收集包涵體。

按照包涵體與8 mol/L尿素溶液比例為1∶15(g/mL)進(jìn)行配比，緩慢攪拌4～6 h使包涵體完全溶解后，4 ℃，10000 r/min離心10 min，取上清液與2 mol/L尿素溶液，按照體積比為1∶60，流速為0.5 mL/min，將變性后的蛋白質(zhì)溶液泵入2 mol/L尿素溶液中，緩慢攪拌過夜，進(jìn)行蛋白質(zhì)的復(fù)性。利用超濾將復(fù)性蛋白中的2 mol/L尿素溶液置換成平衡緩沖溶液(含0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L PB Buffer，pH 7.2)。

1.3.8 融合蛋白純化

融合蛋白具有能與特異性配基結(jié)合的特點，且親和層析法可以將目的蛋白從復(fù)雜的混合溶液中有效地分離出來，本研究將采用親和層析(affinity chromatography，AC)方法分離純化融合蛋白[12]。使用AKTA蛋白純化儀分離純化目標(biāo)蛋白，融合蛋白因含有(His)6-tagged標(biāo)簽，能被Ni2+特異識別并被其吸附在柱體上，停留在柱中，而不含(His)6-tagged標(biāo)簽的雜蛋白樣品隨著緩沖液流出柱體。層析柱使用2倍柱體積的50 mmol/L硫酸鎳溶液進(jìn)行螯合，再使用去離子水沖洗出殘余硫酸鎳溶液，用平衡緩沖溶液(含0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L PB Buffer，pH 7.2)平衡柱子，然后上樣，上樣完成后使用2倍柱體積的平衡緩沖溶液沖洗出未接合的蛋白，待基線平衡后分別使用濃度為20，50，200 mmol/L的咪唑溶液洗脫蛋白，并收集樣品，SDS-PAGE凝膠電泳檢測純化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子菌接種量對表達(dá)量的影響

由圖1和表1可知，當(dāng)種子菌的接種量小于2.0%時，其表達(dá)量隨著接種量的增加而增加，當(dāng)接種量大于2.0%時其表達(dá)量下降，可能的原因是接種量低時培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)較為豐富，而當(dāng)接種量上升其表達(dá)量也隨之上升時，當(dāng)接入過多的菌種后，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)很快被消耗殆盡導(dǎo)致其表達(dá)量反而降低。結(jié)果表明，種子菌的接種量為2.0%時，融合蛋白的表達(dá)量為25.1%，雖然在幾個濃度中其表達(dá)量最高，但是無法滿足工業(yè)生產(chǎn)需要，可能是培養(yǎng)時間較短所致，后期的實驗中應(yīng)延長培養(yǎng)時間以提高融合蛋白的表達(dá)量。

圖1 初始種子菌濃度對融合蛋白表達(dá)量的影響Fig.1 Effect of initial seed bacteria concentration on the expression amount of fusion protein注：M為Marker；1～3為1.0%；4～6為1.5%；7～9為2.0%；10～12為2.5%；13為負(fù)對照。

表1 不同種子菌濃度融合蛋白的表達(dá)量Table 1 The expression amount of fusion protein with different seed bacteria concentration

2.2 誘導(dǎo)時間對表達(dá)量的影響

誘導(dǎo)時間的長短會影響融合蛋白最終的產(chǎn)量，從表達(dá)開始至營養(yǎng)被耗盡的整個過程中，融合蛋白的表達(dá)量及菌體濃度一直在變化。SDS-PAGE凝膠電泳顯示目標(biāo)融合蛋白有很明顯的表達(dá)，隨著誘導(dǎo)時間的延長，融合蛋白的表達(dá)量及菌體濃度均隨之增加，當(dāng)培養(yǎng)10 h后融合蛋白表達(dá)量達(dá)到相對較高的水平，其相對表達(dá)量為31.5%，利用SPSS軟件統(tǒng)計分析表2中7～12 h的融合蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示10～12 h融合蛋白表達(dá)量差異不顯著，說明當(dāng)培養(yǎng)到10 h后其表達(dá)量已達(dá)到較高水平；而由圖3可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌體的OD值隨之增加，當(dāng)培養(yǎng)10 h后其OD值較為穩(wěn)定，一般來說，菌體的數(shù)量會隨著誘導(dǎo)時間的延長而增加，當(dāng)菌體量達(dá)到最高點時，其生長進(jìn)入穩(wěn)定期，活菌數(shù)多，但隨著時間繼續(xù)增長，菌體會進(jìn)入老化期，且外源蛋白也可能會被蛋白酶水解而降低，但本研究中菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期后其表達(dá)量及菌體OD值并沒有隨著時間的延長而降低，可能是因為表達(dá)產(chǎn)物為包涵體，而包涵體的穩(wěn)定性較好，不會被蛋白酶所水解。后續(xù)實驗從節(jié)約時間及成本出發(fā)，選用培養(yǎng)時間為10 h進(jìn)行。

圖2 誘導(dǎo)時間對融合蛋白表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of induction time on the expression amount of fusion protein注：M為Marker；1～12分別為1～12 h；13為負(fù)對照。

圖3 菌體OD600值Fig.3 The OD600 values of bacteria

表2 誘導(dǎo)7～12 h融合蛋白的表達(dá)量Table 2 The expression amount of fusion protein induced for 7～12 h

2.3 誘導(dǎo)溫度對融合蛋白表達(dá)量的影響

溫度在培養(yǎng)的初期主要影響大腸桿菌的生長速率，而到培養(yǎng)中后期影響的是融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的量。由圖4和表3可知，在選定的5個培養(yǎng)溫度下誘導(dǎo)E.coil均能表達(dá)融合蛋白，且溫度對蛋白的表達(dá)水平影響較大，22 ℃時融合蛋白的表達(dá)量僅為8.5%，當(dāng)培養(yǎng)溫度從22 ℃升至37 ℃時融合蛋白的表達(dá)量隨之上升，至31 ℃時融合蛋白的表達(dá)量為30.6%，當(dāng)溫度超過31 ℃時融合蛋白的表達(dá)量基本保持不變，37 ℃時融合蛋白的表達(dá)量為30.5%， 31 ℃與37 ℃融合蛋白的表達(dá)量差異不大。溫度過低，大腸桿菌的生長受到抑制，對培養(yǎng)基中營養(yǎng)的轉(zhuǎn)化率低，導(dǎo)致融合蛋白的表達(dá)量過低；而溫度過高，大腸桿菌生長過快，菌體又容易衰老，并且考慮到溫度對設(shè)備的影響及節(jié)約能源，后期的培養(yǎng)溫度選擇31 ℃。

圖4 誘導(dǎo)溫度對融合蛋白表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of induction temperature on the expression amount of fusion protein注：M為Marker；1～2為25 ℃；3～4為22 ℃；5～6為28 ℃；7～8為31 ℃；9～10為35 ℃；11～12為37 ℃；13為負(fù)對照。

表3 不同溫度條件下融合蛋白的表達(dá)量Table 3 The expression amount of fusion protein under different temperatures

2.4 pH值對融合蛋白表達(dá)量的影響

由圖5和表4可知，培養(yǎng)基pH為5.5時，融合蛋白的表達(dá)量僅占大腸桿菌總蛋白的22.3%；當(dāng)培養(yǎng)基pH值從5.5升至7.0時，融合蛋白的表達(dá)量隨之上升，pH值為6.5時其表達(dá)量占大腸桿菌總蛋白的30.8%，當(dāng)pH值從6.5上升至8.0時，其表達(dá)量差異不顯著，可見培養(yǎng)基的pH值對融合蛋白的表達(dá)也具有一定的影響，從操作的便利性方面考慮，選擇培養(yǎng)基的pH值為6.5進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖5 pH值對融合蛋白表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of pH values on the expression amount of fusion protein注：M為Marker；1～2為pH 5.5；3～4為pH 6.0；5～6為pH 6.5；7～8為pH 7.0；9～10為pH 7.5；11～12為pH 8.0；13為負(fù)對照。

表4 不同pH條件融合蛋白的表達(dá)量Table 4 The expression amount of fusion protein under different pH values

續(xù) 表

2.5 擴大培養(yǎng)

按照上述各單因素的最優(yōu)培養(yǎng)條件，即溫度31 ℃，種子菌濃度2.0%，培養(yǎng)基pH 6.5，誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h，5000 r/min離心后得到濕菌體約為1.2 g/dL，通過SDS-PAGE凝膠電泳檢測其表達(dá)量為30.6%，超聲破菌后SDS-PAGE凝膠電泳顯示絕大部分表達(dá)產(chǎn)物為包涵體，占總大腸桿菌的45.2%，而上清液中可溶表達(dá)僅為5.9%。可溶表達(dá)的優(yōu)點是蛋白質(zhì)純化可以直接上柱分離，不需要變性、復(fù)性，工藝較為簡單，其缺點是表達(dá)產(chǎn)物的量較少。而包涵體表達(dá)有優(yōu)點也有缺點，優(yōu)點是包涵體表達(dá)能很好地避免蛋白水解酶降解表達(dá)產(chǎn)物，并且能避免表達(dá)產(chǎn)物殺死宿主細(xì)胞，使產(chǎn)量大大提高，但是缺點也很明顯，包涵體需要經(jīng)過變性、復(fù)性的過程，加入的變性劑可能會引起融合蛋白的不可逆修飾，形成異構(gòu)體，且工藝較可溶蛋白來說較為復(fù)雜。本研究希望獲得較多的融合蛋白，而采用本研究的方法進(jìn)行融合蛋白的表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物較高，能滿足本研究的研究目的，故本研究將采用包涵體表達(dá)的方法進(jìn)行天蠶素抗菌肽融合蛋白的表達(dá)。

2.6 純化

由圖7可知，目標(biāo)蛋白能很好地結(jié)合到Ni+柱上，只有極少數(shù)的目標(biāo)蛋白隨緩沖液流出柱外，通過不同濃度的咪唑溶液特定洗脫后，其中濃度為20 mmol/L的咪唑溶液洗脫掉了一部分目標(biāo)蛋白及大部分雜蛋白，洗脫的目標(biāo)蛋白占總蛋白的69.2%，200 mmol/L咪唑溶液洗脫的蛋白溶液中目標(biāo)蛋白的純化率能達(dá)到87%左右，該方法能較好地分離出目標(biāo)蛋白且純化率較高。但是由圖6可知，20 mmol/L咪唑溶液洗脫了較大部分蛋白，說明目標(biāo)蛋白的結(jié)合能力較弱，可能是緩沖體系的pH及離子強度等對目標(biāo)蛋白的特異性結(jié)合造成影響；朱一丹等[13]的研究表明，在一定的pH值范圍內(nèi)，pH值越高，蛋白結(jié)合能力越強，而離子的存在使得更多的疏水基團(tuán)得以暴露，增強蛋白質(zhì)的結(jié)合能力；Xu Weiyua等[14]及華偉偉的研究也表明his標(biāo)記的蛋白特異性結(jié)合能力受離子強度和pH等因素的影響，故在后期的研究中應(yīng)加大該方面的研究，使目標(biāo)蛋白結(jié)合更牢，提高目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量。

圖6 擴大培養(yǎng)及超聲破菌Fig.6 The expanded culture and ultrasonic destruction of bacteria注：M為 Marker；1～3為擴大培養(yǎng)后菌體表達(dá)量；4～6為超聲破菌后沉淀；7～9為超聲破菌后上清液；10為負(fù)對照。

圖7 融合蛋白純化Fig.7 The purification of fusion protein注：M為Marker；1為樣品溶液；2為穿流緩沖液；3為20 mmol/L咪唑溶液洗脫蛋白；4為50 mmol/L咪唑溶液洗脫蛋白；5為200 mmol/L咪唑溶液洗脫蛋白。

3 結(jié)論

許多研究者使用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)來誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，然而Dvorak P等[15]的研究表明IPTG會加劇底物的毒性，對大腸桿菌BL21(DE3)宿主造成明顯的損害，該研究還證明了乳糖是比IPTG更好的誘導(dǎo)劑。故本研究利用培養(yǎng)基中的乳糖，自誘導(dǎo)表達(dá)Cecropin A融合蛋白，通過單因素及擴大培養(yǎng)實驗證明該方法具有可行性，具體培養(yǎng)條件為溫度31 ℃，種子菌接種量2.0%，培養(yǎng)基pH 6.5，誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h，最終的融合蛋白的表達(dá)量為30.6%，基本滿足工業(yè)生產(chǎn)需求；菌體破碎后離心得到包涵體，清洗包涵體，再經(jīng)過變性、復(fù)性、超濾等步驟處理包涵體得到復(fù)性后蛋白溶液，最后經(jīng)過親和層析分離出目標(biāo)蛋白，純化率可達(dá)到87%以上。