食醋中總多酚的測定方法及其不同陳醋產品的含量比較

紀鳳娣，魏巍，陶匯源，李東，夏蓉，魯緋*

(1.北京市營養源研究所，北京 100069；2.鎮江恒順生物工程有限公司，江蘇 鎮江 212000)

多酚類化合物是植物次生代謝自然合成的化合物，可以在一些天然食物中找到，由于具有潛在的保健治療作用，這類化合物引起了科學界的廣泛關注[1]。適當攝入具有生物活性的多酚類化合物，在預防糖尿病[2]、肥胖癥[3]、帕金森病[4]、阿爾茨海默病[5]等疾病方面具有良好的效果。目前，多酚在與食品、制藥和材料等有關的應用方面有很大的潛力，也是這些領域的創新熱點。

食醋是我國最受歡迎的調味品之一，有著悠久的生產歷史[6]。隨著食醋對人體健康的潛在影響，其在世界范圍內引起越來越多的關注，已有許多報道證實各種醋具有抗氧化、抗菌、促進疲勞恢復、調節血壓和調節血糖等功能性治療特性[7]。多酚類化合物是食醋的重要特征成分，具有抗氧化活性，對食醋的營養價值和產品品質等指標起著重要作用[8-9]。因此，食醋中總多酚的準確定量，對控制食醋的品質具有十分重要的意義。

多酚類化合物是分子中具有多羥基化合物的總稱，包括黃酮類化合物和酚酸類化合物等[10]。目前，多酚化合物的分析方法主要有高效液相色譜-紫外可見或二極管陣列檢測法[11-12]、毛細管電泳檢測法[13-14]和高效液相色譜-質譜聯用法[15-16]等。與其他方法相比，這些儀器分析方法具有更高的準確性和更低的檢測限，但是，這些基于色譜和質譜的分析方法在應用上也有很大的局限性，包括需要繁瑣的樣品預處理過程和復雜的儀器，造成每個樣品的測試成本偏高。目前，紫外可見分光光度法已廣泛應用于多種分析物的定量分析，但由于光譜重疊性強、選擇性低，在多組分溶液分析中仍面臨挑戰。經典的實驗室總酚含量測定方法是基于光譜檢測的Folin-Ciocalteu法[17-18]，這是一種方便和簡單的分析總酚含量的技術，在葡萄酒等多種食品中總酚含量的測定中有廣泛應用[19-21]。但是，這些方法在樣品處理、試劑用量、顯色反應條件和實際測量以及對照標準品等方面各不相同，數據可比性差。而且，迄今為止，我國也還沒有應用于食醋中總多酚含量測定的統一方法和相關標準。

本試驗采用分光光度法測定食醋中總多酚的含量。Folin-Ciocalteu試劑中的鉬鎢酸鹽氧化多酚化合物中-OH基團并顯藍色，在最大吸收波長760 nm處測定藍色金屬絡合物溶液的吸光度，以沒食子酸作校正標準定量測定食醋中總多酚含量。通過對包括樣品處理、顯色劑用量、顯色條件和測量時間等影響顯色反應的各影響因素進行優化，確定了食醋中總多酚的定量分析方法。該方法簡便、準確且檢測成本低、儀器普及率高、適用性強。此外，也比較了市售的中國四大名醋(包括鎮江香醋、山西老陳醋、福建永春紅曲醋和四川保寧醋)中總多酚的含量。研究結論為我國食醋中總多酚含量測定的行業標準的建立提供了理論依據，為當前我國食醋產業生產中實現產品品質的快速精準檢測提供了有效的技術手段，有利于現階段食醋產品的質量控制和品質評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沒食子酸(98%)：成都埃法生物科技有限公司；Folin-Ciocalteu試劑(相應酸濃度為2 mol/L)：美國Sigma-Aldrich公司；碳酸鈉(分析純)：北京化工廠。所有稀釋液均由美國密理博(Millipore)Milli-Q凈水系統生產的去離子水制備。

鎮江香醋、山西老陳醋、福建永春紅曲醋和四川保寧醋：北京超市市售產品。

1.2 儀器與設備

UV-2550型紫外可見分光光度計 日本島津制作所；LAB MX-F渦旋混合器 大龍興創實驗儀器(北京)股份公司；CF16RN多用途冷凍離心機 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 沒食子酸標準溶液的配制

準確稱取沒食子酸對照品適量于100 mL棕色容量瓶中，用水溶解后定容至刻度，搖勻，配制成濃度約為100 μg/mL的沒食子酸標準溶液。

1.3.2 食醋樣品溶液的配制

準確稱取0.5 g(±0.0001 g)食醋樣品于50 mL棕色容量瓶中，加入約40 mL水，于30～35 ℃超聲30 min，在室溫下用水定容至刻度，搖勻備用(也可于8000 r/min離心后取上清液備用)。

1.3.3 檢測波長的確定

準確量取沒食子酸標準溶液、食醋樣品溶液及水各1 mL分別置于10 mL棕色容量瓶中，加入4 mL水，渦旋混勻，靜置3～5 min后加入0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，渦旋混勻，在1～8 min內各加入1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，渦旋混勻，再用水定容至刻度，搖勻。避光放置于30 ℃水浴中2 h，于200～800 nm進行全波長掃描。

沒食子酸標準溶液和食醋樣品溶液全波長掃描圖見圖1。

圖1 沒食子酸標準溶液(A)和食醋樣品溶液(B)全波長掃描圖Fig.1 The scanning spectra of gallic acid standard solution (A) and vinegar sample solution (B)

由圖1可知，沒食子酸標準溶液和食醋樣品溶液在759.1 nm均有一個最大吸收峰，且空白溶液無干擾，故選擇760 nm作為檢測波長。

1.3.4 沒食子酸標準曲線的制備

準確量取1.3.1項下沒食子酸標準溶液0.20，0.40，0.60，0.80，1.0 mL，分別置于10 mL棕色容量瓶中，各加入4 mL水，渦旋混勻后按照1.3.3項下方法進行顯色，同時以水為空白樣品進行顯色，于760 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標、沒食子酸標準溶液質量濃度為橫坐標進行線性回歸分析。標準溶液的濃度分別為2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μg/mL。

1.3.5 空白溶液的制備

加入5 mL水于10 mL棕色容量瓶中，按照1.3.3項下方法進行顯色，于760 nm處測定吸光度。

1.3.6 食醋測試樣品的制備

準確量取1.3.2項下食醋樣品溶液1.0 mL于10 mL棕色容量瓶中，加入4 mL水，渦旋混勻后按照1.3.3項下方法進行顯色，于760 nm處測定吸光度。每個樣品做3份平行，結果取平均值。

1.3.7 計算公式

式中：W為食醋中總多酚含量(g/100 g)；c為試驗樣品溶液中多酚組分濃度(μg/mL)；m為食醋樣品的稱樣量(g)；結果保留三位有效數字。

2 結果與分析

2.1 食醋樣品溶液制備用溶劑的選擇

準確稱取0.5 g(±0.0001 g)食醋樣品于50 mL棕色容量瓶中，平行3份，分別加入約40 mL水、25%乙醇和50%乙醇，于30～35 ℃超聲30 min，室溫下分別用水、25%乙醇和50%乙醇定容至刻度，搖勻后于8000 r/min離心后取上清液備用。準確量取上述食醋樣品溶液1.0 mL，按照1.3.3項下方法顯色后在760 nm處測定吸光度，綜合分析測定結果，確定水作為食醋樣品溶液的制備用溶劑。

2.2 顯色時間的考察

對試驗樣品的分析中，其他操作不變，加入顯色劑并定容后，在0～180 min內每隔20 min在760 nm處測定吸光度值，結果表明試驗樣品在顯色120 min后，吸光度值趨于穩定，故確定顯色反應時間為2 h，并且在隨后的20 min內測定得到的吸光度值非常穩定。

2.3 顯色劑用量的考察

對試驗樣品的分析中，其他操作不變，僅改變Folin-Ciocalteu試劑的用量(0.25，0.5，0.75，1.0 mL)，或僅改變20%碳酸鈉溶液的用量(1.0，1.5，2.0，2.5 mL)，同法測定吸光度。比較所得吸光度值后確定0.5 mL的Folin-Ciocalteu試劑和1.5 mL的碳酸鈉溶液為最佳顯色劑用量。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準工作曲線

根據1.3.4項下的方法，以沒食子酸標準溶液濃度(μg/mL)為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制標準工作曲線，得到線性回歸方程為Y=0.1148X-0.2087，相關系數R2=0.9992。結果表明沒食子酸在2.0～10.0 μg/mL的濃度范圍內線性關系良好。

2.4.2 精密度試驗

取1.3.4項下10.0 μg/mL的測試用標準溶液，于760 nm處連續測定吸光度9次，RSD為0.051%，表明該方法的精密度良好。

2.4.3 穩定性實驗

準確量取1.3.2項下的食醋樣品溶液1.0 mL，按照1.3.3項下方法進行顯色反應2 h，然后于760 nm處每隔5 min測定一次吸光度值。結果顯示：顯色反應完成后，測試樣品在20 min內吸光度值的RSD為1.40%，表明樣品吸光度值在20 min內基本穩定。

2.4.4 方法的準確性和重復性

以Folin-Ciocalteu法測定總多酚，試驗會受到多種干擾化合物(包括抗壞血酸、糖(果糖和蔗糖)、芳香胺、二氧化硫、有機酸和Fe(II)等)的干擾，這些干擾物質在水溶液中溶解性良好。眾所周知，食醋是以乙酸為主要成分的一種酸味調味料，在我國傳統的食醋中除乙酸外，還含有多種有機酸、氨基酸、碳水化合物、酯類、食鹽和多種微量天然生物活性物質如四甲基吡嗪、黃酮類化合物和酚酸類化合物。目前，我國國家標準GB/T 19777-2013《地理標志產品 山西老陳醋》規定，山西老陳醋中的總黃酮含量應不低于60 mg/100 g，國家標準GB 2719-2018《食品安全國家標準 食醋》規定總酸(以乙酸計)應不低于3.5 g/dL。顯然，高含量的乙酸等有機酸的存在可能會干擾總多酚含量的測定。因此，有必要考察乙酸對試驗的影響。

準確稱取乙酸含量為4.3%的白醋樣品0.5000 g于50 mL棕色容量瓶中，按照1.3項下的方法進行白醋樣品溶液的制備和顯色反應，結果顯示：白醋測試樣品的吸光度值與空白樣品的吸光度值一致，這說明白醋樣品確實不含多酚類化合物，同時也證明食醋中的乙酸對Folin-Ciocalteu法測定總多酚含量的干擾可以忽略。

對測定方法的準確性進行了考察。準確稱定6份0.5000 g的食醋樣品于6個50 mL棕色容量瓶中，精密加入1.3.1項下的沒食子酸標準溶液(沒食子酸的加入量為1081 μg)，按照1.3.2食醋樣品溶液配制方法對樣品進行處理，再依據1.3.3項下顯色條件進行顯色反應并測定吸光度值。食醋樣品加標回收試驗測得的吸光度值和計算的回收率見表1。結果顯示：平均加標回收率為97.2%，相對標準偏差RSD為1.37%，說明該方法的準確性和重復性好，符合食品安全國家標準GB/T 27417-2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》的規定。

表1 食醋樣品加標回收試驗結果Table 1 The results of spiked recovery test for vinegar samples (n=6)

2.4.5 我國四大名醋樣品中總多酚的含量測定

我國各類食醋無論從釀造工藝的特色、產品的質量還是受消費者歡迎的程度，基本上都是從鎮江香醋、山西老陳醋、四川保寧醋和福建永春紅曲醋這4個類型變化和衍生而來的，因此也稱它們為中國四大名醋，是中國傳統釀造食醋的代表。對市售5年陳釀四大名醋中的總多酚含量進行了分析，結果見表2。

表2 中國四大名醋總多酚含量測定結果Table 2 The determination results of total polyphenols＇ content in four Chinese famous vinegar

結果顯示：四大名醋總多酚含量在0.237～0.604 g/100 g的范圍內。其中，四川保寧醋的總多酚含量最高，為0.604 g/100 g，福建永春米醋的總多酚含量最低，為0.237 g/100 g。這證明不同工藝、不同品牌的食醋產品總多酚含量不同，而總多酚含量是評價食醋品質的重要指標之一。

3 結論

本試驗對基于Folin-Ciocalteu法測定食醋中總多酚含量的影響因素進行了考察和優化。通過對食醋樣品處理條件、顯色反應時間、顯色劑用量和測量時間等因素的考察，確定了食醋中總多酚含量的測定方法為：準確稱取0.5 g(±0.0001 g)食醋樣品于50 mL棕色容量瓶中，加入4 mL水，渦旋混勻，靜置3～5 min后加入0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，渦旋混勻，在1～8 min內各加入1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，渦旋混勻后再用水定容至刻度，搖勻。避光放置于30 ℃水浴中2 h顯色，并在20 min內于760 nm處測定吸光度。該方法溶液體系均一，線性良好，準確度和穩定性高，精密度和重復好，儀器普及率高且操作方便、簡單，產生的數據可比性強，易于推廣，可以應用于食醋產品質量控制和品質評價中總多酚含量的測定。