響應面優化超聲輔助提取黃秋葵嫩果黃酮工藝及其清除羥自由基能力

閆旭宇，李娟，李玲

(延安大學 生命科學學院 陜西省紅棗重點實驗室，陜西 延安 716000)

黃秋葵(AbelmoschusesculentusL.)屬于錦葵科秋葵屬一年生草本植物，又名秋葵、補腎草，在我國大部分地區均有種植。黃秋葵作為藥食兩用植物，以嫩果供食用，富含黃酮、多糖、果膠、微量元素、氨基酸等功效成分，具有保肝強腎、降低血糖、清火明目、健胃潤腸、幫助消化、抗疲勞、抗衰老、增強人體免疫力等功能，在食品及調味品領域有著廣泛的應用[1-2]。

黃酮類化合物是一種天然的有效活性成分，在食品加工中廣泛用于各種調味食品和保健食品的生產[3]，具有抗氧化、消炎抑菌、抗腫瘤、降血糖、提高機體免疫力等多種生物活性[4-6]。黃酮類化合物大多含有羥基、甲氧基和異戊烯基等，易溶解于極性較大的有機溶劑。因此，利用乙醇等無毒且易回收的有機溶劑提取黃酮是常用的提取方法之一，而微波、超聲波、加酶等輔助手段有利于提高有機溶劑的提取效率，尤其是超聲波操作簡單、容易控制，通過物理方法破壞植物的細胞壁，不易造成化學污染，縮短提取時間，提高活性成分溶解率和得率[7-8]。同時，黃酮類化合物特有的結構決定了其捕獲活性氧等自由基的能力較強，可作為一種天然、安全、有效的抗氧化劑，減輕過量自由基對機體的損害，進而降低心血管疾病、糖尿病、腫瘤等多種疾病及并發癥的發生[9]。因此，在考慮成本的情況下，采用超聲輔助乙醇提取黃秋葵嫩果黃酮，有助于提高黃酮得率。

黃秋葵作為藥食兩用植物，因其良好的功能和保健作用而愈發受到人們的喜愛，其種植推廣面積逐年增長[10]。因此，深度加工與開發黃秋葵對提高其附加值及資源的利用率具有重要意義。本研究以黃秋葵嫩果為材料，以黃酮得率為指標，利用超聲輔助乙醇提取黃秋葵嫩果黃酮，用響應面設計優化黃秋葵嫩果黃酮的提取工藝條件，并初步研究黃酮對羥自由基的清除作用，以期為進一步開發利用黃秋葵資源提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料與試劑

黃秋葵嫩果：產自陜西延安。

無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、抗壞血酸等試劑(均為國產分析純)：陜西和平化玻有限公司；蘆丁標準品(HPLC≥98%)：上海一基生物試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

FW-100D型植物粉碎機 北京科偉永興儀器有限公司；UV-2600型紫外可見分光光度計、AUX220型分析天平 日本島津公司；WG-71型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；KQ500B型超聲波清洗儀 昆山超聲儀器有限公司；SHZ-D Ⅲ型循環水真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；RE-52CS型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃秋葵嫩果黃酮的提取工藝流程

黃秋葵嫩果→清洗→去梗→切片→60 ℃烘干至恒重→粉碎→過篩(60目)→黃秋葵干粉→超聲輔助乙醇回流提取(250 W)→提取2次合并粗提液→室溫減壓抽濾→濾液旋蒸→定容→提取液。

1.2.2 蘆丁標準曲線的繪制及黃秋葵嫩果黃酮得率的計算

參照閆旭宇等的方法繪制蘆丁標準曲線。以蘆丁為標準品，在已配制好的不同濃度的標準溶液中，依次加入Na(NO2)、Al(NO3)3、NaOH溶液，發生顯色反應。以不加蘆丁對照品溶液為參比，在510 nm處測吸光度，以蘆丁濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程y=1.425x+0.0028，R2=0.9965。

采用Na(NO2)-Al(NO3)3-NaOH法測定總黃酮[11]。根據回歸方程計算出提取液中黃酮的質量濃度，再按照公式(1)計算黃秋葵嫩果黃酮的得率(%)：

(1)

式中：Y為黃酮得率，%；C為提取液中黃酮濃度，mg/mL；V為定容體積，mL；N為稀釋倍數；M為稱量的黃秋葵嫩果粉末質量，g。

1.2.3 單因素試驗設計

1.2.3.1 乙醇濃度對黃秋葵嫩果黃酮得率的影響

稱取5.0 g干燥的黃秋葵嫩果粉末5份，分別加入料液比為1∶30(g/mL)的濃度為55%、60%、65%、70%、75%的乙醇，在60 ℃的條件下超聲30 min，研究乙醇濃度對黃秋葵嫩果黃酮得率的影響。

1.2.3.2 料液比對黃秋葵嫩果黃酮得率的影響

稱取5.0 g干燥的黃秋葵嫩果粉末5份，分別加入料液比為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40(g/mL)的濃度為65%的乙醇，在60 ℃的條件下超聲30 min，研究料液比對黃秋葵嫩果黃酮得率的影響。

1.2.3.3 提取溫度對黃秋葵嫩果黃酮得率的影響

稱取5.0 g干燥的黃秋葵嫩果粉末5份，分別加入料液比為1∶30(g/mL)的濃度為65%的乙醇，分別在50，55，60，65，70 ℃的條件下超聲30 min，研究提取溫度對黃秋葵嫩果黃酮得率的影響。

1.2.3.4 超聲時間對黃秋葵嫩果黃酮得率的影響

稱取5.0 g干燥的黃秋葵嫩果粉末5份，分別加入料液比為1∶30(g/mL)的濃度為65%的乙醇，在60 ℃的條件下超聲20，25，30，35，40 min，研究超聲時間對黃秋葵嫩果黃酮得率的影響。

1.2.4 響應面優化試驗設計

在單因素試驗基礎上，以黃酮得率為響應值，對影響黃秋葵嫩果黃酮得率的乙醇濃度、料液比、提取溫度和超聲時間4個因素的3個水平進行響應面優化試驗，確定超聲波輔助提取黃秋葵嫩果黃酮的最佳工藝條件。各因素的水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface test

1.2.5 黃秋葵嫩果黃酮清除羥自由基試驗

黃秋葵嫩果黃酮及Vc對羥基自由基(·OH)的清除率采用水楊酸法進行測定。其中，黃酮濃度(mg/mL)以黃酮含量計算。·OH的清除率計算公式如下：

(2)

式中：E為·OH的清除率(%)；A0為空白對照液的吸光值；Am為加入黃酮后的吸光值；An為不加H2O2時黃酮的吸光值。

1.3 數據處理

采用響應面分析軟件Design Expert V8.0.6.1的Box-Behnken Design進行試驗設計及數據分析，采用 Excel 2003軟件進行數據統計分析，數據表示為“平均值±標準差”形式。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

由圖1可知，隨著乙醇濃度的提高，黃秋葵嫩果黃酮得率逐漸增加，在65%時達到最高，之后黃酮得率逐漸降低。較高的乙醇濃度會增加其他可溶性物質如蛋白質、兒茶素等的溶出量，降低黃酮相對含量[12]。黃秋葵嫩果黃酮得率隨著提取液體積的增加而增加，料液比為1∶30(g/mL)時的得率略低于1∶35(g/mL)和1∶40(g/mL)時的得率，但考慮到成本，料液比的適宜取值為1∶30(g/mL)。隨著提取溫度由50 ℃上升到60 ℃，黃秋葵嫩果黃酮得率直線上升，在60 ℃時得率最大，高于60 ℃時得率明顯下降。溫度較低時黃酮溶出較慢，但溫度較高時會導致雜質溶出增多，且影響黃酮的穩定性[13]。隨著超聲時間的延長，黃秋葵嫩果黃酮得率先升后降，在30 min時達到最大值，之后黃酮得率明顯下降。超聲提取時間過長不僅增加能耗，而且消耗溶劑并影響黃酮的穩定性和相對含量[14]。因此，考慮到提取成本和黃酮的相對穩定性，選擇4個因素的3個較適宜水平，即乙醇濃度(60%、65%、70%)、料液比(1∶25、1∶30、1∶35，g/mL)、提取溫度(55，60，65 ℃)、超聲時間(25，30，35 min)進行響應面分析。

圖1 乙醇濃度、料液比、提取溫度、超聲時間不同水平下的黃酮得率Fig.1 The yield of flavonoids under different ethanol concentration, solid-liquid ratios, extraction temperatures and ultrasonic time

2.2 響應面設計優化分析

2.2.1 響應面試驗設計與結果

黃秋葵嫩果黃酮提取響應面設計方案及試驗結果見表2，回歸模型方差分析見表3。在響應面試驗結果的基礎上，采用Design Expert 8.0.6軟件進行多元擬合回歸分析，得到黃秋葵嫩果黃酮得率對乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取溫度(C)和超聲時間(D)的四元二次回歸模型方程：

Y=4.60+0.13A+0.15B+0.068C+0.074D+0.12AB+0.035AC+0.032AD-0.038BC+0.012BD-0.13CD-0.33A2-0.25B2-0.28C2-0.2D2。

表2 黃秋葵嫩果黃酮提取響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface test design and results of flavonoids extracted from tender okra fruit

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

續 表

方程的決定系數R2=0.9738，說明有97.38%的響應值變化來源于4個試驗因素，回歸模型方程擬合度良好，預測值與實測值之間的相關性較好，試驗誤差較小，說明此方程較準確可靠，可很好地描述各因素與響應值之間的關系并預測黃秋葵嫩果黃酮的最優提取條件[15]。

由表3回歸模型方差分析結果可知，模型的P<0.0001，極顯著，說明該模型有意義；失擬項的P>0.05，不顯著，說明模型與試驗的差異值較小，可以作為預測黃秋葵嫩果黃酮最優提取工藝參數的模型。回歸模型方差分析中一次項的PA、PB、PC、PD、PAB、PCD、PA2、PB2、PC2、PD2值均小于0.01，說明4個因素的一次項和二次項、乙醇濃度和料液比以及提取溫度和超聲時間的交互項均存在顯著性，而因素間的交互項及失擬項顯著性相對較差。表明4個因素對響應值黃酮得率均存在顯著影響，其關系是一種非線性關系[16]。由方程一次項及F值可知，影響黃秋葵嫩果黃酮得率的因素順序為：料液比>乙醇濃度>超聲時間>提取溫度。

2.2.2 響應面因素間交互作用分析

由表3方差分析可知，乙醇濃度和料液比以及提取溫度和超聲時間的交互作用對黃秋葵嫩果黃酮得率的影響達到極顯著水平(P<0.01)。為更直觀形象地說明其交互影響作用，利用Design Expert 8.0.6軟件做出交互項的等高線圖和響應曲面圖，見圖2。

圖2 乙醇濃度和料液比、提取溫度和超聲時間對黃秋葵嫩果黃酮得率的交互影響Fig.2 Effect of interaction of ethanol concentration and solid-liquid ratio, extraction temperature and ultrasonic time on yield of flavonoids from tender okra fruit

由圖2可知，乙醇濃度和料液比相互作用的響應面曲面坡度較陡峭，等高線呈扁平橢圓狀，說明乙醇濃度和料液比之間的相互作用對黃秋葵嫩果黃酮得率的影響顯著；提取溫度和超聲時間相互作用的響應面亦較陡峭，等高線基本呈扁平橢圓狀，表明提取溫度和超聲時間的相互作用較強，對黃秋葵嫩果黃酮得率的影響亦顯著，但相對次于乙醇濃度和料液比之間相互作用對響應值的影響。

2.2.3 響應面試驗模型與提取條件驗證

用Design Expert 8.0.6軟件進一步分析回歸方程，得出黃秋葵嫩果黃酮提取的最適條件為：乙醇濃度65.28%、料液比1∶30.36(g/mL)、提取溫度60.07 ℃、超聲時間30.2 min，預測得率為4.652%。考慮到實際操作的局限性，提取工藝最終修正為：乙醇濃度66%、料液比1∶31(g/mL)、提取溫度60 ℃、超聲時間31 min。在此條件下進行試驗驗證，重復試驗3次，黃秋葵嫩果黃酮實際得率為4.71%，與預測值(4.652%)接近，其相對誤差為1.25%，表明由Box-Behnken試驗設計所得的黃秋葵嫩果黃酮的最佳提取工藝條件準確可靠。本試驗中超聲輔助乙醇提取黃秋葵嫩果黃酮得率高于正交試驗優化乙醇提取的黃酮得率3.30%[17]，以及高于微波輔助提取的黃酮得率2.78%[18]，這說明與單純的乙醇提取法相比，適宜的超聲提取功率有助于黃秋葵嫩果黃酮的最大溶出，且提取效果好于微波輔助提取。但在相同的提取方法下，本試驗的得率略低于李加興等的得率4.85%[19]，這可能與提取條件不同以及選取材料的不同有關。

2.3 黃秋葵嫩果黃酮對羥自由基的清除作用

生物類黃酮具有較強的清除自由基和抗氧化能力，研制經濟有效的天然黃酮類抗氧化劑替代食品中常用的人工合成抗氧化劑是防治羥基自由基誘發疾病的重要途徑[20]。

由圖3可知，黃秋葵嫩果黃酮對·OH的清除率隨著黃酮濃度的增加而逐漸增加，清除·OH能力與濃度存在一定的量效關系。在相同濃度下，黃秋葵嫩果黃酮對·OH的清除率高于Vc，說明黃秋葵嫩果黃酮具有一定的抗氧化能力。

圖3 黃秋葵嫩果黃酮對羥自由基的清除能力Fig.3 Hydroxyl free radical scavenging ability of flavonoids extracted from tender okra fruit

3 結論

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken法設計響應面優化試驗，得出影響超聲輔助乙醇提取黃秋葵嫩果黃酮的因素依次為：料液比>乙醇濃度>超聲時間>提取溫度，乙醇濃度和料液比以及提取溫度和超聲時間對黃秋葵嫩果黃酮得率的交互影響較強。優化得出的黃秋葵嫩果黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度66%、料液比1∶31(g/mL)、提取溫度60 ℃、超聲時間31 min，在此條件下，黃秋葵嫩果黃酮得率為4.71%。通過對羥自由基的清除試驗發現，在相同質量濃度下，黃秋葵嫩果黃酮提取物對羥自由基的清除效果高于Vc，表明黃秋葵嫩果黃酮具有較強的抗氧化能力，可以作為一種羥基自由基的天然清除劑進行開發應用。本研究結果為黃秋葵嫩果黃酮的規模化提取和開發應用提供了理論參考。