電損毀外側韁核對帕金森病模型大鼠空間學習記憶功能的影響及其機制

韓玲娜 ,王春雷 ,常永麗 ,原 麗 ,劉小靜

（1.長治醫學院生理學教研室，山西 長治 046000；2.長治醫學院生物醫學工程系，山西 長治 046000；3.西安交通大學第一附屬醫院感染科，陜西 西安 710061）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一種由黑質紋狀體多巴胺（dopamine，DA）通路退化引起的以運動功能障礙為主要癥狀的神經退行性疾病。然而，PD 常并發多種非運動癥狀，其中神經精神癥狀和認知功能障礙，因其嚴重影響患者生活質量，受到廣泛關注［1］。PD 患者可表現出多種認知功能障礙，如執行功能、學習記憶障礙和癡呆等［2］，但其神經機制目前尚不清楚。6-羥多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）神經毒性損傷DA 能神經元制備的PD 大鼠模型已經得到公認，并且廣泛應用于PD 的實驗研究中。然而，6-OHDA 毒性所致PD 模型大鼠是否存在認知功能障礙目前結論尚不一致［3-5］。外側韁核（lateral habenular nucleus，LHb）是上丘腦的重要組成部分，是邊緣系統和中腦之間的重要驛站，在抑郁、焦慮、應激、鎮痛、睡眠和認知功能等多方面發揮重要的調節作用。近年來，關于LHb 與學習記憶關系的研究逐漸增多［6-9］。腦中5-羥色胺（serotonin，5-HT）與學習記憶等高級認知功能密切相關，5-HT 通過調節乙酰膽堿、谷氨酸、γ-氨基丁酸和DA 等神經遞質直接或間接影響認知功能。然而，LHb 在PD 認知功能障礙中如何發揮作用，以及是否影響腦中5-HT 水平等問題尚不清楚。因此，本研究采用Morris 水迷宮行為學實驗探討6-OHDA 損毀黑質紋狀體通路對大鼠空間學習記憶功能的影響，以及電損毀LHb 對6-OHDA 所致PD 模型大鼠空間學習記憶功能損害的作用；采用神經化學檢測PD 模型大鼠和電損毀LHb 后PD模型大鼠腦內內側前額葉皮層（medial prefrontal cortex，mPFC）和海馬中5-HT 水平，旨在闡明LHb 在PD 認知功能障礙中的作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器

30 只成年雄性SD 大鼠，體質量220～250 g，由西安交通大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（陜）2012-003，在標準環境下飼養；實驗嚴格執行西安交通大學實驗動物使用相關規定；大鼠隨機分為3 組：對照組、PD 組和PD+LHb 損毀組（每組10 只）。地昔帕明、阿撲嗎啡（apomorphine，APO）和6-OHDA 均為美國Sigma公司產品；地昔帕明溶解于生理鹽水，6-OHDA 和APO 均溶解于含0.02%抗壞血酸的生理鹽水中。SN-2N 動物腦立體定位儀購于日本Narishige 公司，Ethovision 3.0 行為學信號分析系統軟件購于荷蘭Noldus Information Technologu 公司。

1.2 6-OHDA 損毀內側前腦束（medial forebrain bundle，MFB）建立PD 大鼠模型

大鼠經水合氯醛（400 mg·kg－1，腹腔注射）麻醉后，固定于腦立體定位儀上。術前30 min 注射地昔帕明（25 mg·kg－1，腹腔注射）保護去甲腎上腺素能神經元。根據大鼠腦立體定位圖譜確定右側MFB（AP：－4.4mm；L：1.2mm；D：7.8mm），將自制腦內核團局部給藥微量注射器插入右側MFB，以緩慢速度將6-OHDA（12 μg/4 μL）注射至右側MFB。術后1周給予大鼠APO（0.05 mg·kg－1，頸部皮下注射）檢測模型，觀察15 min 內大鼠向健側（左側）旋轉行為，大于20 圈/5 min 視為造模成功［10］，用于下一步實驗。本實驗中所有PD 組大鼠注射APO 后，15 min 內向左側旋轉圈數均大于24 圈/5 min。對照組大鼠采用同樣方法向右側MFB 注射等量含0.02%抗壞血酸的生理鹽水。

1.3 電損毀LHb

6-OHDA 損毀MFB 2 周后，將刺激電極定位于右側LHb（AP：－3.7 mm，L：0.7 mm，D：4.5 mm），用0.5 mA 的直流電刺激PD 組大鼠LHb，刺激10 s 以達到損毀目的［11］。術后大鼠恢復1 周進行下一步實驗。

1.4 大鼠行為學檢測

于MFB 損毀后第4 周檢測大鼠行為學，即LHb 電損毀1 周后進行，實驗在安靜環境中進行。

1.4.1 曠場實驗檢測大鼠自發運動能力 曠場實驗用于評價6-OHDA 損毀MFB 和電損毀LHb 對大鼠自發運動能力的影響。曠場箱尺寸為100 cm（長）×100 cm（寬）×40 cm（高），箱底部分為25 個20 cm×20 cm 的方格，曠場箱上方固定攝像頭。實驗時將大鼠放置于曠場的中心，并記錄5 min 內大鼠穿行格數（number of crossed squares）及用后肢站立的次數（number of rearings），大鼠整個身體均爬過方格方可納入統計，分別檢測大鼠的水平運動能力和垂直運動能力。

1.4.2 Morris 水迷宮實驗檢測大鼠空間學習記憶能力 Morris 水迷宮實驗用于檢測6-OHDA 損毀MFB 和電損毀LHb 對大鼠空間學習記憶能力的影響。水迷宮由一個直徑為15 cm、高50 cm 的宮體和一個水下平臺組成，宮體內表面和平臺涂成黑色。檢測時，宮體內注入水，水溫保持為25 ℃±2 ℃，水下平臺放置于第一象限中心水下1 cm 處。迷宮上方固定有攝像頭，用于采集大鼠在迷宮內的活動軌跡，采集的信號通過行為學信號分析系統軟件進行處理。

Morris 水迷宮實驗分為定位航行實驗和空間探索實驗兩部分。前5 d 進行定位航行實驗，每次將大鼠隨機從一個象限面向池壁放入水中，找到平臺后讓其在平臺上停留10 s，記錄其找到水下平臺時游泳的距離，如果在2 min 內未找到平臺，則引導大鼠至平臺。每天訓練4 次，每次間隔30 s。第6 天進行空間探索實驗，將平臺撤去，將大鼠放入水中讓其自由游泳，記錄大鼠在目標象限（第一象限）中游泳距離占總游泳距離的百分率。在定位航行實驗中大鼠尋找水下平臺游泳距離用于檢測大鼠的空間學習功能，在空間探索實驗中大鼠在目標象限內游泳距離百分率用于檢測大鼠的記憶能力。

1.5 神經化學法檢測各組大鼠腦組織中5-HT水平

采用高效液相色譜-電化學檢測法檢測3 組大鼠腦內mPFC 和海馬組織中5-HT 水平。Morris 水迷宮實驗后，將大鼠迅速斷頭取腦，在平臺上分離右側mPFC 和海馬，稱取質量，按1 mL 0.3 N 高氯酸/4 mg 組織的比例向組織中加入相應體積的高氯酸，組織勻漿后4 ℃低溫離心（15 000 r·min－1，15 min），按照1∶2 的比例將上清液與流動相混合，吸取20 μL 樣品放入自動進樣器中，通過分析柱將5-HT 分離，再經電化學檢測器定量分析，通過標準品溶液建立的標注曲線來確定線性方程，根據出峰時間確定5-HT，通過線性方程計算每克組織中5-HT 水平（ng·g－1）。

1.6 免疫組織化學和組織學染色檢測大鼠腦組織中DA 能神經元的缺失程度和LHb 損毀情況

神經化學法檢測大鼠腦組織中mPFC 和海馬組織后，收集剩余腦組織并置于4%多聚甲醛溶液，2 d 后冰凍冠狀切片，厚度25 μm，用于酪氨酸羥化酶（tyrosinehydroxylase，TH）免疫組織化學染色，確認6-OHDA 損毀后DA 能神經元丟失程度，驗證造模是否成功。TH 染色后DA 能神經元的計數，核圓，核與胞漿完整的細胞被計數，采用每只大鼠選取3 張切片進行計數，最后計算其平均值。尼氏染色，觀察LHb 電損毀情況。2 種具體方法如文獻［10］所述。

1.7 統計學分析

采用SPSS 18.0 統計軟件進行統計學分析。曠場實驗中大鼠穿行格數和站立次數，Morris 水迷宮實驗中大鼠尋找水下平臺游泳距離和目標象限內游泳距離百分比，大鼠腦內mPFC 和海馬組織中5-HT 水平，DA 能神經元數目，均符合正態分布，以表示，其中大鼠尋找水下平臺游泳距離比較采用多重重復測量，大鼠穿行格數、站立次數、目標象限游泳距離百分比以及5-HT 水平比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，損毀側和未損毀側DA 能神經元數目比較采用配對t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 曠場實驗檢測各組大鼠自發運動能力

與對照組比較，PD 組大鼠的穿行格數和站立次數均明顯減少（P＜0.01）；與PD 組比較，PD+LHb 損毀組大鼠的穿行格數和站立次數差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3 組大鼠自發運動能力Tab.1 Locomotor activities of rats in three groups(n=10，）

表1 3 組大鼠自發運動能力Tab.1 Locomotor activities of rats in three groups(n=10，）

*P＜0.01 vs control group.

2.2 Morris 水迷宮實驗檢測各組大鼠空間學習記憶功能

在定位航行實驗中，隨著訓練天數的增加，對照組和PD 組大鼠尋找水下平臺游泳距離均逐漸減少。除訓練第1 天外，與對照組比較，PD 組大鼠尋找水下平臺游泳距離在第2～5 天均明顯增加（第2 天，P＜0.01；第3 天，P＜0.01；第4 天，P＜0.01；第5 天，P＜0.01）。空間探索實驗中，與對照組比較，PD 組大鼠在目標象限內游泳距離占總距離的百分率明顯降低（P＜0.05）。見表2。圖1A 和1B 為對照組和PD 組大鼠在定位航行實驗第4 天的游泳原始軌跡圖。

2.3 Morris 水迷宮實驗檢測電損毀LHb 后PD 模型大鼠空間學習記憶功能

在定位航行實驗中，隨著訓練天數的增加，PD+LHb 損毀組大鼠尋找水下平臺的游泳距離均逐漸減少。除訓練第1 天外，與PD 組比較，PD+LHb 損毀組大鼠的游泳距離在第2～5 天均明顯增加（第2 天，P＜0.01；第3 天，P＜0.01；第4 天，P＜0.01；第5 天，P＜0.01）。在空間探索實驗中，與PD 組比較，PD+LHb 損毀組大鼠在目標象限內的游泳距離占總距離的百分率明顯降低（P＜0.05）。見表2。圖1C 為PD 組和PD+LHb 損毀組大鼠在定位航行實驗第4 天的游泳原始軌跡圖。

圖1 定位航行實驗第4 天3 組大鼠典型游泳原始軌跡圖Fig.1 Typical swimming tracks of rats in navigation experiment on 4th day in three groups

表2 3 組大鼠尋找水下平臺游泳距離和目標象限內游泳距離百分率Tab.2 Distances to find hidden platform and percentages of swimming distance in target quadrant of rats in three groups(n=10，）

表2 3 組大鼠尋找水下平臺游泳距離和目標象限內游泳距離百分率Tab.2 Distances to find hidden platform and percentages of swimming distance in target quadrant of rats in three groups(n=10，）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs PD group.

2.4 各組大鼠腦組織中5-HT 水平

與對照組比較，PD 組大鼠腦內mPFC 和海馬組織中5-HT 水平有降低趨勢，但差異均無統計學意義（P＞0.05），提示PD模型大鼠出現學習記憶功能損傷與mPFC 和海馬組織中5-HT 水平變化無關。

與PD 組比較，PD+LHb 損毀組大鼠mPFC 和海馬且組織中5-HT 水平均明顯降低（mPFC：P＜0.01；海馬組織：P＜0.01），提示LHb 損毀對PD模型大鼠學習記憶功能的進一步損傷與其引起mPFC和海馬組織中5-HT 水平下降有關。見表3。

表3 3 組大鼠mPFC 和海馬組織中5-HT 水平Tab.3 Levels of 5-HT in mPFC and hippocampus tissues of rats in three groups [n=10,,wB/(ng·g－1)]

表3 3 組大鼠mPFC 和海馬組織中5-HT 水平Tab.3 Levels of 5-HT in mPFC and hippocampus tissues of rats in three groups [n=10,,wB/(ng·g－1)]

*P＜0.01 vs PD group.

2.5 免疫組織化學和組織學染色檢測大鼠腦組織中DA 能神經元缺失程度和LHb 電損毀程度

圖2A 和2B 為對照組和PD 組大鼠黑質致密部（substantia nigrapars compacta，SNc）和腹側被蓋區（ventral tegmental area，VTA）TH 免疫組織化學染色圖：對照組大鼠雙側SNc 和VTA 中的DA能神經元數目無明顯變化（圖2A）；PD 組大鼠損毀側（右側）SNc 中DA 能神經元完全缺失，且損毀側VTA 中DA 能神經元明顯減少，僅為未損毀側的（59±17）%（t=6.540，P＜0.01；圖2B）。圖2C 為PD+LHb 損毀組大鼠的LHb 尼氏染色圖，可見右側LHb 被部分損毀。

圖2 對照組（A）和PD 組（B）大鼠TH 免疫組織化學染色結果及LHb 損毀組尼氏染色結果（C）（Bar=400 μm）Fig.2 Results of TH immunohistochemical staining of rats in control(A)and PD(B)groups and result of Nissl’s staining of rats in LHb lesion group(C)（Bar=400 μm）

3 討論

本研究結果顯示：6-OHDA 單側損毀MFB 后，PD 大鼠的運動能力明顯下降，但與PD 組比較，電損毀LHb 后，大鼠的運動能力無明顯變化，表明本研究中單側電損毀LHb 對PD 大鼠在Morris 水迷宮實驗中的行為改變，與其運動能力無直接關系，排除了運動能力對行為學實驗結果的影響。

認知功能障礙是PD 常見的非運動癥狀之一，其中學習記憶功能損傷是PD 認知功能障礙的常見表現，可出現在PD 的早期或晚期［12］。本研究Morris 水迷宮實驗中，與對照組比較，6-OHDA 損毀MFB 后，PD 組大鼠在第2～5 天尋找水下平臺游泳的距離明顯增加，第6 天目標象限內游泳距離百分率明顯降低，即PD 大鼠出現空間學習記憶功能損傷。前期相關研究［3，5，13-17］采用不同的行為學方法也得到了相同的結果：PD 大鼠在不同的記憶任務中出現記憶障礙。還有2 項研究［4，18］顯示：6-OHDA 損毀大鼠無認知行為改變。出現不同結果的原因可能與6-OHDA 注射位點、損毀程度、單雙側損毀以及行為學檢測方法及時間點等多種因素有關。研究［19-20］表明：DA 和5-HT 遞質系統在對包括學習記憶在內的認知功能調節作用發揮重要作用。已有研究［21-23］證實：6-OHDA 單側損毀MFB后，大鼠腦內DA 水平降低，但5-HT 水平不變；本研究結果也顯示：PD 大鼠腦內mPFC 和海馬組織中5-HT 水平未發生明顯變化。上述結果表明：黑質紋狀體通路損毀后腦內DA 水平下降是導致PD 大鼠出現學習記憶能力下降的原因之一。

LHb 與大鼠學習記憶之間關系密切［6-8］，LHb與海馬組織間雖無直接的纖維聯系，但電刺激LHb可以通過中縫中核的5-HT 能神經纖維間接影響海馬錐體神經元的活動［24］，從而改變海馬的Theta 節律，最終發揮對認知功能的調節作用。研究［9］表明：衰老性記憶減退大鼠的LHb 代謝活動明顯降低，損毀LHb 可導致大鼠在水迷宮中的空間記憶能力下降，損毀LHb 與損毀背側海馬后引起的記憶能力下降的行為學表現是完全一致的，提示LHb可能參與記憶形成過程中海馬網絡的整合。5-HT與包括學習記憶在內的認知功能密切相關，海馬組織中5-HT 水平的變化可改變機體的學習記憶能力，5-HT 水平降低可誘發學習和記憶功能障礙，而其水平升高則有促進學習和記憶能力的作用［25-27］。LHb 發出神經纖維投射至中縫核，通過影響5-HT 能神經元的活動而改變腦中5-HT 遞質的釋放。關于LHb 對PD 大鼠認知功能障礙以及對PD 大鼠5-HT 作用的研究目前尚無報道。本研究Morris 水迷宮實驗結果顯示：與PD 組比較，PD+LHb 損毀組大鼠在第2～5 天尋找水下平臺的游泳距離明顯增加，第6 天目標象限內游泳距離百分率明顯下降，提示損毀LHb 加重PD 大鼠空間學習記憶功能的損傷；神經化學檢測結果顯示：PD+LHb 損毀組大鼠腦內mPFC 和海馬組織中5-HT 水平均較PD 組明顯降低。上述結果表明：LHb 對PD 大鼠空間學習記憶功能的調節作用與其調節中腦5-HT 能神經元活性和腦區中5-HT 水平有密切關聯。

本研究結果顯示：MFB 單側損毀所致PD 模型大鼠具有空間學習記憶功能的損傷，損毀LHb 可加重PD 模型大鼠空間學習記憶功能的損傷。基于以往的研究和目前研究結果，本文作者認為：6-OHDA 單側損毀MFB 導致的PD 模型大鼠空間學習記憶功能損傷與腦內DA 水平降低有關，而損毀LHb 加重PD 大鼠空間學習記憶損傷與其導致腦內5-HT 水平降低有關。