莪術醇對小鼠肝竇內皮細胞結構的影響及其對肝內血管新生的抑制作用

鄭 洋 ,王佳慧 ,彭 岳 ,原鮮玲 ,汪 磊 ,趙鐵建

（1.廣西中醫藥大學賽恩斯新醫藥學院醫學系，廣西 南寧 530222；2.廣西中醫藥大學基礎醫學院生理教研室，廣西 南寧 530222）

肝纖維化病因復雜，任何能造成肝臟慢性損害的因素均可導致肝臟發生纖維化，如慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、脂肪性肝炎、自身免疫性肝病、血吸蟲肝病和藥物性肝病等［1］，因此防治肝纖維化對于慢性肝病患者具有十分重要的臨床意義［2］。肝內血管新生是肝纖維化的病理形態特征，也是肝纖維化難以逆轉的重要病理原因［3］。肝竇內皮細胞（liver sinusoidal endothelial cells，LSEC）是肝內非實質細胞中的一類，也是肝血竇的主要組成細胞，其細胞表面有很多窗孔結構，有利于肝內的物質交換。肝纖維化發生時，LSEC 會介導肝纖維化特征病理改變“肝竇毛細血管化”的形成［4］，導致肝內大量血管新生，但是主要為未成熟的無效血管，不僅難以改善肝組織營養缺乏狀態，反而加劇了肝實質細胞缺血缺氧損傷［5］。血管內皮標志物分化抗原簇 31（cluster of differentiation 31，CD31）和血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）等LSEC 表型也發生較大改變。有研究［6］表明：肝內血管新生在肝纖維化疾病中扮演十分重要的角色。廣西莪術（Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang）是姜科姜黃屬中藥莪術（Rhizoma Curcumae）的一種，通常以其干燥塊根入藥，其行氣逐瘀和破血散結的功效作用比較強［7］。莪術醇作為廣西道地藥材莪術主要活性成分，莪術醇具有活血化瘀、保肝、抗炎和利膽等多種功效。目前關于莪術醇對肝內血管新生作用的報道較少，其具體的作用機制尚不明確。本研究通過探討莪術醇對肝內血管新生的作用，闡明莪術醇抗肝纖維化的分子機制，為莪術醇防治肝纖維化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器SPF 級KM 小鼠30 只，2 周齡，體質量為12～16 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002，動物使用許可證號：SYXK（桂）2019-0001。小鼠適應性飼養2 周后進行后續實驗。莪術醇（貨號：C114054）和丹參酚酸B（貨號：S101148）（上海阿拉丁生物公司），MTT（上 海BIOSHARP 公 司，貨 號：0793），Matrigel（北京拜爾迪生物科技有限公司，貨號：354230），Trizol（美國Ambion 公司，貨號：15596-026），CD31 抗體（貨號：Ab222783）和vWF 抗體（貨號：Ab174290）（英 國Abcam 公 司），GAPDH 抗體（杭州賢至生物有限公司，貨號：AB-P-R001）。酶標儀（北京普天新橋技術有限公司，型號：PT-350C），顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號：IX51），倒置顯微鏡（蘇州景通儀器有限公司，型號：XSP-11CD），RT-qPCR 儀（美國ABI 公司，型號：QuantStudio 6）。

1.2 LSEC 原代分離培養和分組小鼠按照80 mg·kg－1體質量使用劑量10 g·L－1戊巴比妥鈉進行腹腔注射麻醉，200 μL 肝素靜脈注射抗血液凝固。解剖腹部后用導管插入門靜脈，剪開肝臟的下腔靜脈，采用無鈣GBSS 進行肝臟灌流，溫度37 ℃，輸液泵灌流速度為10 mL·min－1，輸灌量約200 mL。結扎下腔靜脈。用39 ℃的膠原酶溶液，以5 mL·min－1的流速行肝臟再灌注，灌注20 min 后，摘取肝臟，剝掉肝臟包膜和血管，將該膏樣肝臟物質在新鮮的膠原酶溶液中振蕩。細胞懸液通過尼龍紗布過濾以濾去未消化的組織，所得的濾過液為肝臟細胞懸液，使用Percoll 密度梯度沉降法及細胞選擇性貼壁法分離原代肝竇內皮細胞［8］，主要步驟包括：GBSS 液肝臟灌注→膠原酶肝臟灌注→膠原酶溶液振蕩→細胞懸液離心去除雜質→Percoll 密度梯度沉降。將得到的LSEC 放至適宜的培養基中培養，待細胞生長達80%融合時，用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA 消化收集細胞，將細胞分為空白對照組、模型組、莪術醇組和丹參酚酸B 組。將細胞密度調整至5×104mL－1，接種到96 孔細胞培養板，每孔100 μL 細胞懸液，空白對照組細胞僅用普通培養基處理，模型組細胞用100 μg·L－1廋素活化，培養細胞48 h，莪術醇組細胞先用45 mg·L－1莪術醇處理30 min 再用廋素培養細胞48 h［9］，丹參酚酸 B 組細胞先用1×10－6mmol·L－1丹參酚酸B 處理30 min 再用廋素培養細胞48 h，每組設置6 個復孔。

1.3 MTT 法檢測各組細胞增殖率取對數生長期細胞，胰酶消化后，將細胞密度調整為7×104mL－1，接種到96 孔細胞培養板，每組設6 個復孔，每孔100 μL 細胞懸液，并設置空白孔，在細胞孔周圍孔內加入適量無菌PBS 緩沖液，培養過夜后，每孔加入10 μL MTT，37 ℃培養4 h，吸出培養基，加入DMSO 振蕩數分鐘，酶標儀測定吸光度（A）值，根據A 值測出細胞增殖率。細胞增殖率=（實驗組A 值－空白組A 值）/（對照組A 值－空白組A 值）× 100%。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）法檢測各組細胞中CD31 和vWF mRNA 表達水平利用Trizol 試劑提取總RNA，采用primer 5.0軟件，由武漢巴菲爾生物科技公司合成引物。引物序列：CD31，上游引物5'-TCCGATGATAACCACTGCAA-3'，下游引物，5'-GTGGTGGAGTCTGGAGAGGA-3'；vWF，上游引物5'-GCTCTCTCTCTCTTACCCGGATG-3'，下游引物 5'-ATACTCCTTGCCCTGATGGA-3'；β-actin，上游引物 5'-GCAGGAGTACGATGAGTCCG-3'，下游引物5'-CCTGACAATGACTCGACGCA-3'。按照逆轉錄試劑盒，合成cDNA，反應條件：95 ℃、1 min；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，40 個循環，以β-actin 作為內參對照，取PCR 產物進行凝膠成像分析，每個樣本的mRNA 相對表達水平=2－△△Ct，△Ct=目的基因Ct 值－GAPDH Ct 值，每組進行6 次重復。

1.5 免疫印跡法檢測各組細胞中CD31 和vWF 蛋白的表達提取細胞總蛋白，使用BCA 法測定各組細胞蛋白濃度，行SDS-PAGE 電泳、轉膜，用TBST 液室溫搖床封閉2 h，加入CD31 和vWF，GAPDH 抗體4 ℃過夜，使PVDF 膜浸泡于二抗孵育液中，通過ECL 顯色系統顯色，用BandScan 軟件分析膠片灰度值，將各組目的蛋白灰度值與內參蛋白（GAPDH）灰度值的比值作為目的蛋白相對表達水平。

1.6 掃描電鏡觀察各組LSEC 的結構各組孵育的細胞爬片，2.5%的戊二醛固定2 h；0.1 mol·L－1磷酸緩沖液沖洗3 次；1%鞣酸處理1 h，1%四氧化鋨后固定1 h；磷酸緩沖液再次沖洗；梯度乙醇溶液（50%、70%、90%和100%）連續脫水，每個梯度濃度脫水15 min，再次用100% 乙醇脫水3 次，每次15 min；用臨界點干燥器對細胞標本進行臨界點干燥，金屬濺射；掃描電鏡觀察樣品。

1.7 血管形成實驗檢測各組LSEC 血管新生數量4 ℃融化Matrigel 膠，按每100 μ L 均勻加至96 孔細胞培養板底部；低速無菌離心去除氣泡；37 ℃孵育60 min，在40 min 時取對數生長期LSEC，按照5×104mL－1密度接種于96 孔細胞培養板，用無血清DMEM 培養基繼續培養；各組用不同試劑處理后，在倒置顯微鏡下觀察管腔形成情況，每孔隨機選取6 個視野，使用Image J 軟件統計完整管腔數。

1.8 統計學分析采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計學分析。各組細胞增殖率、細胞中CD31 和vWF mRNA 及蛋白表達水平以及各組細胞血管形成數量均符合正態分布，以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KM 小鼠原代LSEC 分離的結果在顯微鏡下觀察分離的KM 小鼠原代LSEC，12 h 后，細胞呈圓形，而后細胞逐步生長為卵圓形，見圖1A 中箭頭；36 h 后，卵圓形細胞漸漸變成紡錐形，如圖1B 中箭頭，細胞生長較好。

圖1 KM 小鼠LSEC 原代分離結果（×40）Fig.1 Primary isolation results of LSEC of KM mice（×40）

2.2 各組細胞增殖率MTT 法檢測各組細胞增殖率，模型組細胞增殖率較空白對照組明顯降低（P＜0.05）；莪術醇組和丹參酚酸B 組細胞增殖率較模型組明顯降低（P＜0.05）；莪術醇組細胞增殖率較丹參酚酸B 組升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組細胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of cells in various groups（n=6，-）

表1 各組細胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of cells in various groups（n=6，-）

*P＜0.05 compared with blank control group；△P＜0.05 compared with model group.

2.3 各組細胞中CD31 和vWF mRNA 表達水平模型組細胞中CD31 和vWF mRNA 表達水平較空白對照組升高（P＜0.05）；莪術醇組和丹參酚酸B 組細胞中CD31 和vWF mRNA 表達水平較模型組明顯降低（P＜0.05）；莪術醇組與丹參酚酸B 組CD31 和vWF mRNA 表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。表明莪術醇具有抑制連續性血管生成的作用。見表2。

表2 各組細胞中CD31 和vWF mRNA 表達水平Tab.2 Expression levels of CD31 and vWF mRNA in cells in various groups（n=6，）

表2 各組細胞中CD31 和vWF mRNA 表達水平Tab.2 Expression levels of CD31 and vWF mRNA in cells in various groups（n=6，）

*P＜0.05 compared with blank control group；△P＜0.05 compared with model group.

2.4 各組細胞中CD31 和vWF 蛋白表達水平模型組細胞中CD31 和vWF 蛋白表達水平較空白對照組升高（P＜0.05）；莪術醇組和丹參酚酸B 組細胞中CD31 和vWF 蛋白表達水平較模型組明顯降低（P＜0.05）；莪術醇組與丹參酚酸B 組細胞中CD31 和vWF 蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。表明莪術醇具有抑制血管新生的作用。見圖2 和表3。

表3 各組細胞中CD31 和vWF 蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of CD31 and vWF proteins in cells in various groups（n=6，）

表3 各組細胞中CD31 和vWF 蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of CD31 and vWF proteins in cells in various groups（n=6，）

*P＜0.05 compared with blank control group；△P＜0.05 compared with model group.

圖2 各組細胞中CD31 和vWF 蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of CD31 and vWF proteins in cells in various groups

2.5 各組小鼠LSEC 的窗孔結構掃描電鏡檢測結果顯示：在正常LSEC 中，有大量開放的窗孔；而模型組開放的窗孔數量減少；莪術醇組LSEC 窗孔數量較模型組增加。表明莪術醇可改善LSEC 窗孔開放情況，改善肝內的微循環。見圖3。

圖3 各組小鼠LSEC 窗孔結構（Bar=50 μm）Fig.3 Structures of fenestrations of LSEC of mice in various groups（Bar=50 μm）

2.6 各組小鼠LSEC 新生血管數量血管形成實驗結果顯示：模型組小鼠LSEC 新生血管數量較空白對照組增加（P＜0.05）；莪術醇組和丹參酚酸B組小鼠LSEC 新生血管數量較模型組減少（P＜0.05）；莪術醇組與丹參酚酸B 組新生血管數量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。表明莪術醇具有抑制血管新生的作用。見圖4 和表4。

表4 各組小鼠肝內新生血管數量Tab.4 Number of new blood vessels in liver of mice in various groups（n=6，）

表4 各組小鼠肝內新生血管數量Tab.4 Number of new blood vessels in liver of mice in various groups（n=6，）

*P＜0.05 compared with blank control group；△P＜0.05 compared with model group.

圖4 各組小鼠LESC 中肝內血管形成情況（Bar=100 μm）Fig.4 Formation of intrahepatic blood vessels in LESC of mice in various groups（Bar=100 μm）

3 討論

肝纖維化是多種慢性損傷因素作用于肝臟所引起的應答反應，進一步發展會導致肝硬化和肝癌的發生［10］。肝纖維化是各種慢性肝病的共同病理過程，以肝星狀細胞激活大量細胞外基質沉積為主要特征［11］。LSEC 是覆蓋于肝竇的薄層扁平狀細胞，表面富含窗孔，窗孔直徑為100～150 nm，為肝竇和Disse 間隙之間物質交換通道。研究［12］顯示：原代分離的具有窗孔表型的LSEC 與肝星狀細胞共培養時，肝星狀細胞活化的標志物α-平滑肌肌動蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）的表達明顯降低，LSEC 可使肝星狀細胞恢復靜息狀態。DELEVE 等［13］在活化的肝星狀細胞中加入LSEC，并且給予可溶性鳥苷酸環化酶活化劑維持LSECs 的窗孔表型，結果顯示：活化型肝星狀細胞逆轉為靜息狀態。LSEC 調控肝星狀細胞活化的作用，可能與其調控肝內物質交換有密切關系。肝纖維化與肝臟血管生成密切相關，可促進肝內血管生成，血管生成又加劇了肝纖維化［14］。因此針對LSEC介導的肝內血管新生，成為防治肝纖維化的研究熱點［15］。

本課題組前期研究［16］顯示：莪術醇具有抑制Rho/ROCK 信號通路，從而抑制HSC 的活化，發揮抗肝纖維化作用。近期研究［9］顯示：莪術醇可以增加LSEC 窗孔結構。肝內血管新生是一種缺氧啟動和生長因子依賴的動態病理過程，缺氧誘導因子1α 在細胞受低氧刺激時誘導產生并活化，是組織缺氧的重要反應［17］。血管新生程度取決于缺氧的程度及細胞對缺氧誘導因子1α 的反應［18］，研究［19-21］表明：缺氧誘導因子1α 是一種氧濃度調節的轉錄因子，隨著肝損傷加重，組織缺氧區域擴大，缺氧誘導因子1α 高表達，可刺激肝星狀細胞激活并通過誘導下游血管內皮生長因子表達和轉錄，促進血管新生，改善局部組織血供，暫時緩解肝組織的缺氧，但是過度的血管新生會導致大量無效血管生成，這種血管不能進行物質交換反而加重肝臟的損傷。肝臟的微循環是以肝竇為中心，門靜脈與肝動脈終末支經肝竇至細小肝靜脈間的血液循環，肝血竇不同于一般的毛細血管，LSEC 之間存在窗孔，形成篩板樣結構，并缺乏連續性基底膜，肝竇毛細血管化的主要特征是LSEC 的失窗孔和內皮下連續性基底膜的形成［22］。內皮細胞表達CD31和vWF，且常被作為連續性血管形成的標志，正常的LSEC 不表達CD31 和vWF，在LSEC 介導肝竇毛細血管化時會大量表達，因為其表型發生了轉變［23-24］。血管生成與重構是肝纖維化發生過程中非常重要的環節，以血管生成與重構為靶點進行藥物干預，可能成為抑制或逆轉肝纖維化的有效手段［25］。

本研究以LSEC 為研究對象，從KM 小鼠分離原代LSEC，通過肝臟膠原酶灌注結合Percoll 密度梯度沉降法獲得呈紡錐形生長良好的原代細胞；分子生物學檢測結果顯示：莪術醇可以抑制CD31 和vWF 的表達，表明在莪術醇的干預下，連續性血管生成減少；掃描電鏡實驗結果顯示：模型組LSEC 窗孔數量明顯減少，從而導致肝內微循環障礙物質交換受限，促進了肝纖維化發生，而莪術醇組LSEC 窗孔數量較模型組明顯增加，說明其具有改善肝內微循環的作用；血管形成實驗結果顯示：模型組有大量新生血管形成，莪術醇干預后血管新生數量明顯減少。

綜上所述，莪術醇通過調控LSEC 的結構，抑制肝內血管新生，可能是其抗肝纖維化的機制之一。血管新生與肝纖維化發生相促相伴，血管新生是肝纖維化重要的早期病變，但是本研究只觀察到莪術醇抑制肝內血管新生的作用，并未對其調控的分子機制進一步的探討，未來本課題組將進一步深入研究莪術醇對肝竇毛細血管化介導的血管新生調控機制。