胰島素樣生長因子1 受體抑制劑NVP-AEW541 對ESCC 細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其機制

曹雅杰 ,包曉紅 ,李書珍 ,耿海營 ,蔡曾曉瑞 ,代春美 ,李 寧,4,5

（1.錦州醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，遼寧 錦州 121001；2.臺州學院醫學院基礎醫學部細胞生物學學科，浙江 臺州 318000；3.錦州醫科大學藥物研究所，遼寧 錦州 121001；4.錦州醫科大學生物人類學研究所，遼寧 錦州 121001；5.遼寧省人類表型組重點研究實驗室，遼寧 錦州 121001）

食管癌是我國六大惡性腫瘤之一，且我國食管癌類型多為食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）［1］。當前的腫瘤生物治療技術包括分子靶向藥物、單克隆抗體、細胞因子、基因治療和細胞免疫治療［2-3］。食管癌的治療包括外科手術治療、化學療法和放射療法在內的多學科治療。但總體預后較差，全球食管癌5 年生存率為10%～25%［4］。目前，外科治療是食管癌的主要臨床治療方法。近年來，特異性強、不良反應小的分子靶向治療在中晚期食管癌治療中取得一定的效果［5-6］，可有效降低并發癥的發生［7］。

研究［8-10］表明：腫瘤細胞能夠自分泌或旁分泌產生胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factors-1，IGF-1），與胰島素樣生長因子1 受體（insulin-like growth factors-1 receptor，IGF-1R）結合并活化，促進腫瘤細胞的有絲分裂、遷移和轉移，抑制其凋亡，加快上皮-間質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）過程的發生，從而增強腫瘤細胞病灶轉移成為惡性腫瘤的可能性。NVP-AEW541 對IGF-1R 具有高選擇性，可以穿過腫瘤細胞膜阻斷細胞內部生長分裂的信號通路，通過抑制IGF-1R 的自身磷酸化，阻斷下游的磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphosyl inositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB）通路，從而達到抑制細胞增殖，加快細胞凋亡的作用［11-12］。目前，針對NVP-AEW541 的研究多處于臨床前階段，在腎上腺皮質癌［13］、乳腺癌［14］、胃腸神經內分泌腫瘤［15］、結直腸癌［16］、胃腸道間質瘤［17］和黑色素瘤［18］的靶向治療中起著極為重要的作用。本研究通過探討NVP-AEW541 對ESCC 細胞增殖、遷移和侵襲的影響，初步闡明該藥物對食管癌細胞遷移和侵襲的作用機制，為NVP-AEW541 用于食管癌的臨床治療提供基礎實驗數據。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑和儀器人KYSE450、KYSE30 和TE-1 細胞株購于南京科佰生物科技有限公司；NVP-AEW541 購于瑞士諾華制藥公司，RPMI 1640 培養基購于美國Hyclone 公司，標準胎牛血清購于美國Gemini Bio 公司，青霉素-鏈霉素混合試劑購于北京Solarbio 公司，胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）和CCK-8 試劑購于北京鼎國昌盛有限公司，二甲亞砜（DMSO）試劑購于美國Sigma-Aldrich 公司，BCA 定量試劑盒購于美國Thermo Scientific 公司，兔抗磷酸化IGF-1R（p-IGF-1R）抗體購于美國 Cell Signaling Technology 公司，兔抗N-Cadherin 抗體購于美國Proteintech 公司，兔抗Snail-1 抗體購于武漢愛博泰克公司，辣根酶標記山羊抗兔IgG HRP 和鼠抗β-actin 抗體購于上海優寧維公司，山羊多克隆抗體二抗抗小鼠IgG-H&L 購于英國Abcam 公司，ECL 發光液和0.1%結晶紫試劑購于上海碧云天生物技術公司。Transwell 板和Matrigel 基質膠購于美國康寧公司，Amersham Imager 600 型GE 超靈敏多功能成像儀購于美國GE 公司，ST 16R 型高速冷凍離心機購于賽默飛世爾（中國）有限公司，3-B 型Carl Zeiss 光學顯微鏡購于德國卡爾蔡司公司，PS-20A 型超聲波清洗機購于上海煜南儀器有限公司，QYC-200 型恒溫搖床購于上海新苗醫療器械制造有限公司，DW-86L386 型立式超低溫保存箱和HR40-IIA2 型生物安全柜購于青島海爾特種電器有限公司，ThermoHERAcell 240i 型CO2細胞培養箱購于美國Thermo 公司，TJ-600 型三用恒溫水浴鍋購于江蘇同君儀器科技有限公司，Synergy H1 型BioTek 酶標儀購于美國BioTek 公司，DMI4000 B 型熒光倒置顯微鏡和DM IL LED 型漩渦混合儀購于德國Leica 公司，L500 型離心機購于長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司，GFL-620 型電熱鼓風干燥箱購于天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司。

1.2 NVP-AEW541 分子靶向藥物的配制用DMSO 配 制10 mmol·L－1的NVP-AEW541 儲備液并凍存于－20 ℃冰箱中。NVP-AEW541 的實驗溶液在處理細胞前用RPMI 1640 完全培養基現配制。

1.3 細胞培養將KYSE450、KYSE30 和TE-1細胞于含10%標準胎牛血清、1%的青霉素-鏈霉素混合試劑的RPMI 1640 培養基中培養，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中，為后續實驗提供對數生長期細胞。

1.4 CCK-8 法檢測各組細胞存活率收集對數生長期KYSE30、KYSE450 和TE-1 細胞，以每孔8×103個細胞接種于96 孔細胞培養板，培養24 h，加入NVP-AEW541 實驗溶液，使每孔溶液為100 μL 含不同濃度（0、2、4、6、8 和10 μmol·L－1）NVP-AEW541 的藥物培養基，每個濃度設3 個復孔，設3 個空白對照（RPMI 1640 完全培養基）。培養48 h，每孔加入15 μL CCK-8 試劑，培養3 h，酶標儀檢測450 nm 波長處各孔吸光度（A）值，計算細胞存活率。細胞存活率=（加藥組A 值－空白組A 值）/（未加藥組A 值－空白組A 值）×100%。

1.5 細胞劃痕法檢測各組細胞遷移率收集對數生長期KYSE30、KYSE450 和TE-1 細胞，以每孔5×105個細胞接種于6 孔細胞培養板，置于37 ℃、5% CO2培養箱中過夜培養。用200 μL 移液器吸頭在孔中劃痕，棄液并用PBS 緩沖液清洗1 遍，加入2 mL 不同濃度（0、2、4 和 6 μ mol·L－1）NVP-AEW541 的含0.5%胎牛血清的培養基，培養24 h 并在顯微鏡（×100）下拍攝不同時間段（0、6、12 和24 h）的照片記錄細胞遷移情況，用Image J 和Image Lab 軟件計算并整理細胞劃痕面積。實驗重復3 次，計算細胞遷移率。細胞遷移率=（0 h 劃痕面積－N h 劃痕面積）/0 h 劃痕面積×100%。

1.6 Transwell 法檢測各組細胞侵襲數將Matrigel 基質膠從－20 ℃冰箱中取出融化，按1∶50 比例用RPMI 1640 基礎培養基稀釋，放入Transwell 小室中，置于37 ℃培養箱固化2 h。收集對數生長期KYSE30、KYSE450 和TE-1 細胞，以每孔5×104個細胞接種于Transwell 小室中，使上室每孔為100 μL 不同濃度（0 和6 μmol·L－1）NVP-AEW541 且無血清的培養基，下室為500 μL RPMI 1640 完全培養基，37 ℃培養48 h，棄培養基，用無菌棉簽擦拭孔室，下室加500 μL 結晶紫溶液，染色30 min，棄液并用PBS 緩沖液清洗。在顯微鏡（×100）下隨機選取5 個視野，照相和計算穿過膜的細胞數量。實驗重復3 次。用Image J 軟件計算侵襲細胞數。

1.7 Western blotting 法檢測各組細胞中p-IGF-1R、N-Cadherin 和Snail-1 蛋白表達水平收集對數生長期KYSE30、KYSE450 和TE-1 細胞，以每孔3×105個細胞接種于6 孔細胞培養板，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜。棄培養基，加入2 mL 不同濃度（0、4 和6 μmol·L－1）NVPAEW541 的培養基，37 ℃培養48 h。棄培養基，PBS 緩沖液洗滌，加入細胞裂解液（含1%PMSF），冰上放置1 min，刮板集中裂解細胞后，12 000 r·min－1、4 ℃離心5 min，取上清。BCA 法檢測并計算蛋白濃度。取蛋白質按每孔30 μg 進行10%SDS-PAGE 電泳并轉移至硝酸纖維素（PVDF）膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST 或含5% BSA 的TBST 封閉液，室溫下封閉2 h。一抗（1∶1 000）孵育4 ℃過夜，TBST 洗膜4 次，每次8 min。加二抗（1∶5 000）室溫孵育90 min，TBST 洗膜3 次，每次10 min。用ECL 試劑發光，拍照。采用Image Lab 軟件分析各個條帶的灰度值，以β-actin 為參照，計算目的蛋白表達水平。目標蛋白表達水平＝目標蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.8 統計學分析采用GraphPad Prism 8.01 軟件進行統計學分析。各組細胞存活率、遷移率、侵襲數和細胞中p-IGF-1R、N-Cadherin 及Snail-1 蛋白表達水平均符合正態分布，以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，實驗重復3 次。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞存活率采用0、2、4、6、8和10 μmol·L－1NVP-AEW541 處理 KYSE30、KYSE450 和TE-1 細胞48 h 后，CCK-8 法檢測3 種ESCC 細胞增殖情況，結果見圖1。隨著NVPAEW541藥物濃度的升高，與對照組（0 μmol·L－1）比較，實驗組（10 μmol·L－1）KYSE30、KYSE450和TE-1 細胞存活率均明顯降低，分別為25.51%（P＜0.01）、7.07%（P＜0.01）和19.29%（P＜0.01），3 種ESCC 細胞的存活率比較差異均有統計學意義（P＜0.01），呈一定的濃度依賴關系，KYSE450 細胞對NVP-AEW541 最為敏感。在藥物濃度為10 μmol·L－1時，3 種細胞的細胞存活率明顯降低，達到基本抑制ESCC 細胞增殖的效果。

圖1 各組ESCC 細胞存活率Fig.1 Survival rates of ESCC cells in various groups

2.2 各組ESCC細胞遷移率采用0、4和6 μmol·L－1NVP-AEW541 處理KYSE30、KYSE450 和TE-1細胞24 h，對照組（0 μmol·L－1）KYSE450 和TE-1細胞的劃痕閉合情況最佳，細胞遷移率分別為97.5% 和94.0%，而KYER30 細胞遷移率為57.54%。與對照組比較，4 μmol·L－1NVPAEW541 處理KYSE30、KYSE450 和TE-1 細胞24 h，細胞遷 移率分別為17.02%±0.01%、32.66%±0.02% 和9.01%±0.01%（P＜0.01）；6 μmol·L－1NVP-AEW541 處理 KYSE30、KYSE450 和TE-1 細胞24 h，細胞遷移率分別為4.64%±0.01%、16.86%±0.01% 和 3.17%±0.04%（P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組ESCC 細胞遷移情況和細胞遷移率Fig.2 Migration of ESCC cells and cell migration rates in various groups

2.3 各組ESCC 細胞侵襲數采用0 和6 μmol·L－1NVP-AEW541 處理KYSE30、KYSE450 和TE-1細胞48 h，結果見圖3。6 μmol·L－1NVP-AEW541處理后，對照組的3 種細胞穿過小室的細胞鋪滿染色后的膜，與對照組比較，實驗組KYSE30、KYSE450 和TE-1 細胞分別有40.76%、30.51%和42.41%的細胞穿透過膜，實驗組3 種細胞侵襲數明顯減少（P＜0.01）。見圖4。

圖3 各組ESCC 細胞侵襲情況（結晶紫，×100）Fig.3 Invasion of ESCC cells in various groups（Crystal violet，×100）

圖4 各組ESCC 細胞侵襲數Fig.4 Number of invasion ESCC cells in various groups

2.4 各組細胞中蛋白表達水平與對照組比較，KYSE30、KYSE450 和TE-1 細胞中p-IGF-1R 蛋白表達水平均降低，分別降低68.05%、83.83%和76.13%（P＜0.01）。實驗組KYSE30 細胞中N-Cadherin 和Snail-1 蛋白表達水平較對照組分別降低81.72%（P＜0.01）和72.12%（P＜0.01）；實驗組KYSE450 細胞中N-Cadherin 和Snail-1 蛋白表達水平較對照組分別降低68.84%（P＜0.01）和80.64%（P＜0.01）；實驗組TE-1 細胞中N-Cadherin 和Snail-1 蛋白表達水平較對照組分別降低81.48%（P＜0.01）和85.39%（P＜0.01）。NVP-AEW541 處理均可降低 ESCC 細胞中N-Cadherin 和Snail-1 蛋白表達水平（P＜0.01）。見圖5 和6。

圖5 各組ESCC 細胞中侵襲相關蛋白表達電泳圖Fig.5 Electrophoregram of invasion-related proteins in ESCC cells in various groups

3 討論

IGFs 系統作為生命體生長發育過程中的重要組成部分，可以調節并參與生命體的發育過程，其中包含IGF-1R［19］。當IGF-1R 與IGF-1 結 合，通過自身磷酸化激活RAS/絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和PI3K/PKB 通路，從而促進細胞增殖。本研究結果顯示：隨NVP-AEW541 濃度升高，ESCC 細胞存活率降低，細胞中p-IGF-1R 蛋白表達水平降低，表明NVP-AEW541 對ESCC 細胞增殖有抑制作用，其中NVP-AEW541 可以競爭性靶向結合受體IGF-1R，下調IGF-1R 表達，阻礙下游通路激活，從而達到抑制細胞增殖的效果。

多數腫瘤細胞中的IGF-1R 表達過量，當IGF-1 和IGF-1R 結合時，使其下游主要信號轉導通路PI3K/PKB 激活，促進食管癌細胞增殖、遷移和侵襲，形成惡性腫瘤，而食管癌復發和病灶轉移是食管癌根治的主要阻力。本研究結果顯示：提高NVP-AEW541 濃度，劃痕細胞遷移率降低，侵襲細胞數減少且間質細胞標志物N-Cadherin 和轉錄因子Snail-1 蛋白表達水平降低，NVP-AEW541 對ESCC 細胞遷移和侵襲有明顯抑制作用。已往研究［20-21］表明：IGF-1R 抑制劑對乳腺癌和卵巢癌等其他腫瘤細胞的遷移均具有抑制作用，即IGF-1R抑制劑可能阻礙腫瘤細胞的轉移。

目前，國內主要通過食管癌的TNM 分期采用不同的臨床治療方法［22-23］。多數食管癌確診病例已發生病灶轉移［24-26］，需采用放化療手段治療，但是晚期食管癌患者的全身營養狀況較差，使得化療的毒副作用和放療的較高局部復發率和轉移率導致食管癌治療的后期總體效果并不理想［27-29］。盡管食管癌治療在外科手術和放化療等方法上取得了重大進展，但是患者的預后較差，迫切需要新的療法來改善食管癌患者的生活質量。本研究結果顯示：隨NVP-AEW541 藥物濃度的增加，對ESCC 細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用增強，然而，需要高濃度的NVP-AEW541 才能有效抑制ESCC 細胞的增殖，限制濃度的藥物治療可能會降低NVPAEW541 的藥物作用，降低治療效果。導致NVPAEW541 高濃度用藥的原因可能是當細胞存活的信號轉導通路被阻斷，其他的轉導通路就會選擇性被活化并維持腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲的發生［30-31］。因此，考慮到更有效的治療結果和濃度限制，NVP-AEW541 聯合藥物治療可能較NVPAEW541 單藥治療更具有發展前景，同時抑制多條信號轉導通路，多靶向結合腫瘤細胞膜上轉導細胞增殖、遷移和侵襲的受體為食管癌治療提出新的思路。

圖6 各組ESCC 細胞中侵襲相關蛋白表達水平Fig.6 Expression levels of cell invasion-related proteins in ESCC cells in various groups