六種殺菌劑對黨參根腐病病菌的室內毒力測定

劉 露，曹 劍，許 彥，黃志偉，覃貴勇

（重慶三峽職業學院，重慶萬州 404155）

藥材黨參為桔梗科植物黨參的干燥根，功效與人參相似，為常用藥材。黨參味甘性平，入脾、肺經，是補氣養血的常見藥材。隨著黨參種植面積的持續擴大，部分地區連作重茬等，病害問題已逐漸成為影響黨參產量和品質的重要因素之一，其中根腐病是發生最為常見且嚴重的病害[1]，根腐病菌的厚垣孢子抗逆性強，在無寄主存在時也可在土壤中存活多年，導致發生愈加嚴重。黨參根腐病于4 月中下旬發生，平均病株率相對較低，在8 月病株率最高。早期發病時，側根表面或下部須根初現褐色小斑點，輕度腐爛，隨后逐漸蔓延到主根，根部自下向上逐步腐爛，出現黑褐色水漬狀病斑。發病后，地上部莖和葉隨著根的腐爛由下而上逐漸變黃，以致枯死。如發病較晚，秋后剩下部分多為半截參。次年春天，留下的半截參雖可發芽出苗，但不久便會繼續腐爛，地上部葉片也相應變黃，逐漸枯死[2]。根腐病常常導致黨參產量下降，質量變劣，有的甚至完全失去藥用價值，給藥農造成極大損失。根腐病菌的小種較多，各地區的發生及防控各有差異，尤其重慶氣候濕潤，更適合黨參根腐病的發生，導致目前重慶黨參根腐病的防控難度較大。本文針對重慶地區分離出的致病菌進行最佳抑菌劑的篩選試驗，希望篩選出較為理想的防治殺菌劑，為該病的綜合防控提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

從重慶奉節黨參（川黨參Codonopsis tangshenOliv.）種植基地采集的根腐組織上分離所得菌株，本文編號為P5。

1.1.2 供試殺菌劑

此次試驗選取市面上常見的，可用于防治根腐病的6種殺菌劑（見表1）。

表1 供試殺菌劑基本情況

1.1.3 培養基

馬鈴薯瓊脂培養基（簡稱PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 L。

清水瓊脂培養基（簡稱WA）：瓊脂30 g，蒸餾水1 L。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離

組織分離：將生病根部切成約5 cm 長的小段，浸泡于75%酒精中約30 s后，在0.1%升汞水溶液中浸約1 min，后用無菌水換洗3 次，放在干燥的無菌紙上吸干水分后，用滅菌手術刀在病害標本病健交界處切取邊長為3 mm 左右的立方塊組織，并將其移置于PDA培養基平板中央，將培養皿倒置于25 ℃恒溫培養箱中培養3～5 d后觀察。

單孢分離：在超凈工作臺上，用無菌手術刀將WA 平板切成邊長約為1.0 cm×2.0 cm 的塊狀，放置在滅菌載玻片上，并將其平均切成8 塊0.5 cm×0.5 cm 的小塊。使用針灸針沾取根腐病菌分離物，連續在8 塊WA 平板上各輕觸1 下，隨后在4×10 倍顯微鏡下觀察孢子。最后將沾有單孢的瓊脂塊，轉移至PDA 中央，倒置于25 ℃恒溫培養箱中培養，保存備用。

1.2.2 含毒介質制備

將供試殺菌劑按照表2 對應的質量濃度配置成不同濃度含毒培養基，以無殺菌劑加入的PDA 平板作為對照[3]。每皿培養皿倒入20 mL 培養基，每個殺菌劑濃度5個重復。

表2 各供試殺菌劑含毒培養基質量濃度

1.2.3 不同化學殺菌劑對黨參根腐病病原菌菌落生長的抑制作用

菌絲生長速率法：使用直徑為5 mm 的無菌打孔器在菌落樣本邊緣處打下菌餅[3]。取菌餅移入對應培養基中心位置，使用封口膜密封培養皿邊緣使之隔絕污染，用標簽作相對應標記，將平板放置于25 ℃恒溫條件下培養。接種后，在培養第3 d、5 d、7 d 時，采用十字交叉法測量菌落直徑，并按照如下公式，計算6種殺菌劑對應的抑制生長率。

1.2.4 數據整理

以殺菌劑質量濃度的對數值為x，抑制率值為y，使用Excel 進行回歸分析，得毒力回歸方程y=ax+b，求出決定系數（R2）及EC50。使用DPS 9.01 對數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 殺菌劑處理P5后菌落生長情況

試驗結果表明，在相同濃度處理下，6 種不同藥劑對P5 菌落的生長抑制作用有明顯影響。十三嗎啉、甲基硫菌靈、苯醚甲環唑、福美雙對P5均有明顯抑制作用，噁霉靈對其抑制作用稍差，噻呋酰胺對其抑制作用不明顯。其中十三嗎啉、甲基硫菌靈明顯優于其他殺菌劑的處理，實際觀察發現，這兩種殺菌劑處理下的P5菌落生長邊緣不平整，說明菌絲的生長受到較大阻礙。其余菌落邊緣生長平滑，說明其余4 種殺菌劑對菌絲的生長形態沒有太大影響。此外，從各菌落培養基顏色來看，各殺菌劑對P5分泌色素的能力有一定影響。十三嗎啉、甲基硫菌靈處理下的菌落培養基顏色偏紅且較深，說明藥劑并未過多減少其色素的產生。福美雙處理下的菌落培養基稍紅但顏色較淺，說明該藥較前兩種藥劑，對其色素的分泌起到了更大程度的抑制。苯醚甲環唑、噁霉靈、噻呋酰胺處理下的菌落培養基顏色幾乎沒有變化，說明3 種藥劑較好地抑制了P5分泌色素。

2.2 生長速率法測定各殺菌劑的抑制作用

從表3 可以看出，各藥劑的EC50值差異較大，苯醚甲環唑、甲基硫菌靈、十三嗎啉對P5的生長抑制作用明顯優于其他幾種殺菌劑，說明P5對這幾種殺菌劑更為敏感，其中十三嗎啉的抑制作用最好。福美雙、噁霉靈對P5的生長抑制作用稍弱，但其用量也低于生產上常規劑量，說明其抑制效果也較好。而24%噻呋酰胺的EC50值高達55 258.62×10-3g·L-1，抑制效果不明顯。

表3 6種殺菌劑不同濃度對P5菌絲生長的毒力回歸方程

從表4 置信區間數據可以看出，苯醚甲環唑和十三嗎啉、甲基硫菌靈和十三嗎啉對P5的生長抑制作用差異不顯著，其余各藥劑相互間對P5的生長抑制作用的差異顯著，說明藥劑間的抑制作用差異明顯。

表4 殺菌劑兩兩EC50比率的95%置信區間

3 討論

本文的毒力回歸方程能夠有效地反映出不同濃度的殺菌劑與抑制菌落生長的關系，本次試驗采用菌絲生長速率法測定了6 種殺菌劑對黨參根腐病的室內毒力，結果表明，6 種殺菌劑對黨參根腐病病菌P5 的抑制作用由強到弱順序為十三嗎啉＞甲基硫菌靈＞苯醚甲環唑＞福美雙＞噁霉靈＞噻呋酰胺。十三嗎啉、甲基硫菌靈對菌絲生長有明顯抑制，苯醚甲環唑、噁霉靈、噻呋酰胺能有效減少病菌色素分泌。十三嗎啉、苯醚甲環唑、甲基硫菌靈對P5生長抑制作用最好，噁霉靈、福美雙對P5生長抑制作用稍弱；噻呋酰胺抑制效果最差，在生產上不作推薦。

十三嗎啉、甲基硫菌靈、苯醚甲環唑、福美雙、噁霉靈這5 種殺菌劑均有抗菌譜較廣、高效、低毒的特點，對本試驗中的病菌P5有較好的抑制效果。建議生產上可多種殺菌劑交替使用，以有效控制黨參根腐病害，防止病原菌對某種單一試劑產生抗藥性。

室內藥劑篩選試驗結果僅代表藥劑與病原菌直接接觸時，藥劑對病原菌生長的抑制效果，而藥劑在田間對病害的實際防治效果還與藥劑作用機理、施藥方式、施藥天氣狀況等因素有關。下一步可選用在室內毒力測定中對黨參根腐病病菌抑制效果較好的殺菌劑進行后續試驗。