載三氧化二砷殼聚糖微球的制備、表征及釋藥性能

張亮 王靖 劉昌勝 黃曉春* 陳統一

(1.復旦大學附屬中山醫院骨科，*康復醫學科，上海 200032；2.華東理工大學醫用生物材料教育部工程研究中心，上海 200237)

三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)的藥用歷史悠久，除作為早幼粒白血病的經典抗腫瘤藥物外，它還可促進乳腺癌、前列腺癌、骨肉瘤和尤文肉瘤等多種實體腫瘤細胞的凋亡[1-2]。研究[3-4]表明1～2 μmol/L濃度的As2O3就能有效抑制骨肉瘤和尤文肉瘤細胞的增殖。

載As2O3磷酸鈣骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)在骨腫瘤手術中修復重建骨缺損的同時，可抑制局部腫瘤生長。但CPC直接載荷As2O3會延長骨水泥的固化時間并降低力學強度，其藥物釋放往往呈爆發性，難以緩慢持續地釋藥[5]。殼聚糖由甲殼素脫乙酰化形成，具有生物可降解性、生物相容性和分解產物無毒性等特點，因此優于工業生產的其他有機共聚物[6]。殼聚糖的三聚磷酸鈉交聯產物帶正電荷，不易溶解、溶脹較小，性質較為穩定。以三聚磷酸鈉為離子凝膠劑制備的殼聚糖微球的水溶性、載藥性能及藥物緩釋效果均較好[7-8]。本研究將殼聚糖微球作為As2O3的載體，探討載As2O3殼聚糖微球的制備工藝，并觀察其表征和體外藥物釋放性能，為后期復合材料的研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 藥品與試劑 殼聚糖(上海偉康有限公司)，As2O3(北京雙鶴藥業)，三聚磷酸鈉、丙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫脲、氫氧化鉀和鹽酸(上海凌峰化學試劑有限公司)。

1.2 儀器 S23-2恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司)，微膠囊成型裝置(上海理工大學)，透析袋15000(上海源聚生物科技有限公司)，FD-3真空冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)，AFS-930雙道原子熒光光度計(北京吉天儀器有限公司)，AJ-5805注射泵(上海安吉電子設備有限公司)，TE200-U倒置顯微鏡(日本尼康公司)，Nicolet 5700傅立葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared，FT-IR)儀(美國Thermo公司)，X-射線衍射儀(德國Bruker公司)。

1.3 載As2O3殼聚糖微球的制備 稱取一定量的殼聚糖粉末至燒杯，加入離子水，邊攪拌邊加入冰醋酸；等溶液透明緩慢加入As2O3，過濾去除不溶物質后靜止去泡，配制成2％殼聚糖溶液。用真空注射器吸取5 mL殼聚糖溶液加入到注射器，將注射器加載在微球成型裝置上。注射泵以90 mm/h的注射速度加載，電壓37～39 kV，將殼聚糖溶液滴加到50 mL三聚磷酸鈉和丙酮的混合液中制成微球。微球迅速轉移，并梯度淋洗至7 mL離心管冷凍過夜，冷凍干燥1 d。

1.4 載As2O3殼聚糖微球的包封率測定 微球成型操作前另取5 mL殼聚糖溶液，并于微球成型操作后收集含載藥微球溶液的上清液，采用原子熒光法分別檢測殼聚糖溶液和上清液中砷的含量。包封率=(殼聚糖溶液中總的砷含量-上清液中砷含量)/殼聚糖溶液中總的砷含量×100％。

1.5 載As2O3殼聚糖微球的表征觀察 分別于光鏡和電鏡下觀察載藥微球的成球效果，并進行粒徑分析、FT-IR分析和X-射線衍射分析。

1.6 藥物體外釋放 根據中國藥典二部配制模擬體液，取30 mg含1％ As2O3的殼聚糖微球置入50 mL模擬體液中，置入37 ℃恒溫箱內。于0.5、1、1.5、2、4、8、12和24 h各取3 mL樣本，采用原子熒光法檢測砷的含量。每次取樣后分別補充3 mL模擬體液。

2 結 果

2.1 包封率測定 載As2O3殼聚糖微球的包封率為(87.3±6.5)％。

2.2 成球效果 載As2O3殼聚糖微球在倒置顯微鏡和掃描電鏡下成球效果較好，微球粒徑較小，大小基本均一，分布較滿意，凍干后微球表面稍有褶皺。見圖1～2。

圖1 倒置顯微鏡下載As2O3殼聚糖微球觀察結果(A：×20；B：×100)

圖2 掃描電鏡下載As2O3殼聚糖微球的成球效果

2.3 粒徑分析 載As2O3殼聚糖微球的粒徑為10～500 μm，平均(239.5±11.2)μm。見圖3。

2.4 FT-IR分析 載As2O3殼聚糖微球和殼聚糖的FT-IR有明顯差異。與殼聚糖原料粉末的FT-IR比較，殼聚糖與三聚磷酸鈉作用后，3447.7 cm-1羥基伸縮振動峰移到了3405.7 cm-1，1636.1 cm-1出現了尖峰，1596.5 cm-1的峰移到了1541.2 cm-1，1257 cm-1處羥基彎曲振動減小，說明與三聚磷酸鈉交聯后，殼聚糖微球的結構發生了變化，形成了較強的分子間和分子內氫鍵。見圖4。

圖3 載As2O3殼聚糖微球粒徑分析

CS：殼聚糖，CM+As：載As2O3殼聚糖微球

2.5 X-射線衍射圖譜分析 殼聚糖原料粉末的特征峰有2θ=10.1°和19.9°。在殼聚糖微球中未出現這種特征峰，取而代之的是微球結晶度明顯降低所形成的饅頭峰，表明三聚磷酸鈉和殼聚糖之間發生了較強的相互作用。見圖5。

CM+As：載As2O3殼聚糖微球；CS：殼聚糖粉末；CM：空白殼聚糖微球

2.6 藥物體外釋放 載As2O3殼聚糖微球置入模擬體液中的4 h內，藥物快速釋放，之后藥物釋放量平緩上升。24 h內As2O3累積釋放量為(30.8±0.5)％。同時，模擬體液中As2O3藥物濃度維持在(2.3±0.1)～(4.7±0.1)μmmol/L。見圖6。

圖6 載As2O3殼聚糖微球的藥物釋放曲線

3 討 論

殼聚糖是一種天然聚陽離子堿性多糖，是甲殼素脫乙酰基衍生物，來源廣泛，可從蝦蟹殼中大量提取，且價格低廉。它具有多種生物活性，能與活體組織相容，不會引起過敏和排斥反應；其降解產物也能完全地被人體吸收，無不良反應，因此，殼聚糖適于作為緩控釋藥物的輔料[6]。殼聚糖包封藥物后，可使藥物釋放減慢、療效延長，不良反應減少。殼聚糖微球制備的方法有乳化分散法、油相干燥法、噴霧干燥法、交聯聚合法和凝聚法等[6]。本研究采用靜電液滴法制備殼聚糖微球，以含As2O3殼聚糖溶液為原料液，三聚磷酸鈉和丙酮的混合液為凝膠浴，結果顯示，該法制備的微球成球效果良好。研究[7]表明，高壓靜電發生技術制備載藥殼聚糖微球具有工藝簡便、制備條件溫和、效率高、速率快、生物物質活性損失少等優點。

在高壓靜電場中，殼聚糖溶液克服黏滯力和表面張力，以液滴狀落入凝膠浴，通過殼聚糖陽離子與三聚磷酸根陰離子之間的電荷作用，使殼聚糖微球從溶液中沉淀析出。凍干后的載藥微球不粘連，再次分散性良好，這得益于其表面的正電荷；靜電斥力的存在使得微球在較長時間內保持穩定，且殼聚糖微球與三聚磷酸鈉交聯后，形成了較強的分子間和分子內的氫鍵，也使得載藥微球不易溶解，更加穩定[8-9]。

本研究中，FT-IR和X-射線衍射分析也表明，三聚磷酸鈉和殼聚糖之間發生了較強的相互作用，殼聚糖結晶程度降低。微球成形速度較快時，殼聚糖分子鏈來不及進行充分的有序結晶排列；此外，交聯后的殼聚糖結構較復雜，部分羥基參與反應，破壞了原來殼聚糖分子的規整性，使得交聯后殼聚糖的晶相區減少。這些交聯固化后的反應導致了殼聚糖結晶程度的降低，使殼聚糖接近于無定形，因而提高了殼聚糖分子鏈親水性，使得載藥殼聚糖微球的水溶性更強[10]。

殼聚糖內具有一定的活性基團，可以結合藥物，使藥物大量分布于交聯結構內并緩慢釋放。因此，包封在殼聚糖微球內的藥物具有明顯的緩釋、控釋或延時釋藥的特征[8,11]。Shavi等[12]在應用載阿那曲唑殼聚糖微球抗乳腺癌治療的研究中發現，殼聚糖微球經三聚磷酸鈉交聯固化后，其藥物釋放在最初4 h內較為迅猛，之后則釋放平緩，48 h內藥物累積釋放量為(73.04±1.6)％。本研究中，含1％ As2O3的載藥殼聚糖微球藥物釋放也于4 h內快速上升，隨之緩慢增加；雖然24 h藥物累積釋放量僅為30％左右，但同時，模擬體液中As2O3的濃度維持于2～5 μmmol/L，已達到抑制骨腫瘤細胞增長所需藥物濃度的要求[3-4]。

綜上所述，采用靜電液滴法制備載As2O3殼聚糖微球工藝簡單可靠，所得載藥微球水溶性較好，表征較為滿意，包封率高，藥物釋放較為平緩，在載藥微球復合型骨修復材料的研究及應用中具有潛在的優勢。

[1]Kritharis A,Bradley TP,Budman DR.The evolving use of arsenic in pharmacotherapy of malignant disease[J].Ann Hematol,2013,92(6):719-730.

[2]Wang Y,Wei Y,Zhang H,et al.Arsenic trioxide induces apoptosis of p53 null osteosarcoma MG63 cells through the inhibition of catalase[J].Med Oncol,2012,29(2):1328-1334.

[3]Jung HS,Kim HS,Lee MJ,et al.Arsenic trioxide concentration determines the fate of Ewing's sarcoma family tumors and neuroblastoma cells in vitro[J].FEBS Lett,2006,580(20):4969-4975.

[4]黃曉春,李澤兵,陳增淦,等.活細胞實時成像技術研究抗壞血酸(AA)協同砷劑抗人骨肉瘤MG-63的體外療效[J].復旦學報(醫學版),2012,39(6):649-652.

[5]Bose S,Tarafder S.Calcium phosphate ceramic systems in growth factor and drug delivery for bone tissue engineering:a review[J].Acta Biomater,2012,8(4):1401-1421.

[6]Islam MA,Firdous J,Choi YJ,et al.Design and application of chitosan microspheres as oral and nasal vaccine carriers:an updated review[J].Int J Nanomedicine,2012,7: 6077-6093.

[7]Mi Y,Su R,Fan DD,et al.Preparation of N,O-carboxymethyl chitosan coated alginate microcapsules and their application to Bifidobacterium longum BIOMA 5920[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl,2013,33(5):3047-3053.

[8]Martins AF,de Oliveira DM,Pereira AG,et al.Chitosan/TPP microparticles obtained by microemulsion method applied in controlled release of heparin[J].Int J Biol Macromol,2012,51(5):1127-1133.

[9]Zeng W,Huang J,Hu X,et al.Ionically cross-linked chitosan microspheres for controlled release of bioactive nerve growth factor[J].Int J Pharm,2011,421(2):283-290.

[10]Estevinho BM,Rocha FA,Santos LM,et al.Using water-soluble chitosan for flavour microencapsulation in food industry[J].J Microencapsul,2013,30(6):571-579.

[11]Park JM,Lee SY,Lee GH,et al.Design and characterisation of doxorubicin-releasing chitosan microspheres for anti-cancer chemoembolisation[J].J Microencapsul,2012,29(7):695-705.

[12]Shavi GV,Nayak UY,Reddy MS,et al.Sustained release optimized formulation of anastrozole-loaded chitosan microspheres:in vitro and in vivo evaluation[J].J Mater Sci Mater Med,2011,22(4):865-878.