鳥嘌呤核苷酸交換因子在胃癌組織中的表達及其臨床意義

胡欣雨 姚暉 夏冬 Sami UL Haq Niazi

在我國，胃癌的發病率僅次于肺癌，死亡率排第3位，全球每年胃癌新發病例約120萬，中國約占40%。早期胃癌病人的生存率能達到90%，但早期胃癌缺乏特異性癥狀與體征,導致其早期檢出率較低。我國早期胃癌的檢出率僅10% 左右,嚴重影響病人的預后[1]。有研究表明，腫瘤的浸潤、轉移與病人的預后密切相關，取決于腫瘤遷移和侵襲中信號通路的失調。Rap蛋白(Ras-associated-Protein)是小GTP酶Ras家族中的一員，參與細胞黏附、細胞連接、侵襲、遷移等功能，同時又是細胞信號傳遞過程中多個信號通路交叉點的關鍵分子[2]。Rap鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors,GEFs)可從無活性的Rap1蛋白釋放GDP，結合GTP從而激動Rap蛋白，促進其后續活化。Crk蛋白通過介導蛋白質復合物的形成在細胞信號通路中發揮重要作用，并已在多種腫瘤中發現其過表達促進了細胞的擴散及侵襲[3]，其中C3G(Crk SH3-domain-binding guanine-nucleotide exchange factor)就是最普遍表達的Rap鳥苷酸交換因子。有研究表明，在腫瘤中C3G基因存在的一些突變與病人存活率的降低有關[4]。來自不同的公共基因數據庫的信息顯示，C3G表達水平在胃癌中有所增加。C3G可能可以作為一種新的胃癌診斷、預后標志以及一個新的治療靶點。我們通過國外公共信息大數據分析C3G蛋白在胃癌組織及正常組織中的表達，采用免疫組化分析檢測胃癌及癌旁組織中C3G的表達并分析其相關臨床、病理資料，了解胃癌的發生、發展及預后是否與C3G的表達有相關性，探討C3G在胃癌的發生、發展過程的作用。

對象與方法

一、對象

2012年12月～2015年12月我院就診的符合納入標準的胃癌病人121例。男性62例，女性59例；年齡≥60歲66例，<60歲55例；中-高分化腺癌76例，低分化腺癌45例；伴有淋巴結轉移64例，無淋巴結轉移57例；浸潤深度T1-2 49例，T3-4 72例。收集所有符合納入標準的胃癌病人的癌組織及癌旁組織(距離病灶組織距離至少5 cm以上的正常胃黏膜組織)。納入標準：(1)一般臨床資料及病理資料均保存完整；(2)術前均未接受放療、化療及生物治療輔助治療手段；(3)未合并其他系統惡性腫瘤；(4)手術方式為根治性切除術，術后病檢確診為胃癌；(5)術后接受常規隨訪，未失聯。

二、方法

1.C3G的表達采用免疫組化法。病理組織蠟塊經資深病理醫師閱片確認后切片、烤片，用二甲苯常規脫蠟、水化，置于EDTA緩沖液中微波修復，5%BSA(牛血清白蛋白)封閉后加入一抗，4 ℃過夜，PBS溶液清洗后滴加相應種屬的二抗，37 ℃孵育，其后每片加入50～100 ml DAB溶液，顯色完全沖洗后蘇木素復染，鹽酸酒精分化，再次沖洗后氨水反藍，流水沖洗，經過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡下閱片，每張切片中含有的正常胃黏膜、炎性細胞等作為內對照，先使用低倍鏡，后用高倍鏡。結果判定：C3G陽性細胞為位于細胞質內的棕黃色顆粒或團塊，且觀察不少于5個高倍鏡視野。當陽性染色的細胞≤10%時定為陰性表達，即弱表達；>10%為陽性表達。使用Image J軟件計算其陽性面積及IOD值，分析所選病例癌組織及癌旁組織平均光密度(IOD/area)。

2.基因數據庫分析：登陸Oncomine數據庫(https://www.oncomine.org/)獲取權限后按以下數據檢索條件進行檢索：(1)Gene:C3G(RapGEF1)；(2)Analysis Type:CANCER vs NORMAL；(3)Cancer Type:gastric cancer。以上篩選條件均設置為p-Value:1E-4；Fold Change。

3.隨訪：采用電話與臨床查閱病歷的方式隨訪，記錄所納入研究的病人生存時間，隨訪日期截止至2020年8月10日，平均隨訪時間為55.10個月。

三、統計學方法

結果

1.基因數據庫結果：根據檢索條件搜索到6個數據集，篩選符合條件的研究數據(排除胃腸道腫瘤類別)。薈萃分析表明，與正常組織比較，C3G在胃癌組織中表達高于正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 Oncomine數據庫中C3G在胃癌組織及癌旁組織中表達的薈萃分析

2.免疫組化染色：在胃癌及癌旁組織中，C3G蛋白陽性表達率分別為70%(112/160)及31.25%(50/160)。計算其平均光密度(IOD/area)，C3G在腫瘤細胞中表達為(0.108±0.025)，在癌旁組織中表達為(0.059±0.017)，差異有統計學意義(P<0.05)，證明C3G在胃癌組織中呈高表達。見圖2、圖3。

A：癌旁組織C3G陽性(蘇木素染色×400)；B：癌旁組織C3G陰性(蘇木素染色×400)；C：胃癌組織C3G陽性(蘇木素染色×400)；D：胃癌組織C3G陰性(蘇木素染色×400)

圖3 C3G蛋白在胃癌組織及癌旁組織表達結果

3.C3G蛋白表達與胃癌病人預后的關系 ：隨訪結果顯示，截至2020年8月10日，C3G蛋白陽性表達68例，死亡30例，存活38例；C3G蛋白表達陰性53例，死亡8例，存活45例。通過Kaplan-Merier生存曲線分析，C3G蛋白陰性表達組平均生存時間為58.1個月(95%CI：56.2～59.9)，C3G蛋白陽性表達組平均生存時間為53.7個月(95%CI：51.3～56.1)，C3G蛋白陽性表達組生存結局劣于C3G蛋白陰性表達組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 胃癌病人C3G蛋白陽性表達與陰性表達的總生存曲線

4.終點事件：以隨訪結束時，病人是否死亡為因變量，以C3G蛋白表達情況、年齡、性別、腫瘤浸潤深度、腫瘤分化程度、淋巴結是否轉移為自變量，通過χ2檢驗可知，與存活組比較，死亡組女性偏多，腫瘤浸潤深、分化程度高、伴有淋巴結轉移、C3G蛋白陽性表達的病人所占比例較高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 存活組與死亡組臨床、病理資料對比(例，%)

5.胃癌組織中C3G蛋白陽性表達與病人臨床資料的關系： 單因素分析顯示，性別、C3G蛋白陽性表達、腫瘤浸潤深度及淋巴結是否轉移是為影響胃癌病人死亡的獨立危險因素(P<0.05)。根據單因素分析的結果進一步納入風險比例回歸模型分析，結果表明，蛋白的陽性表達、胃癌腫瘤浸潤深度及淋巴結是否轉移仍是有意義(P>0.05)。見表2、表3。

表2 影響胃癌病人死亡的單因素Cox分析

表3 影響胃癌病人死亡因素的多因素Cox分析

討論

C3G，也稱RapGEF1，作為Ras大家族中重要成員，如Rap1及R-Ras的鳥苷酸核酸因子[5]，在癌癥的發生發展中起重要作用。有研究表明，Rap 1通過抑制小GTP結合蛋白Ras到c-Raf-1的信號轉導來抑制促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路的活化[6-7]，也可以通過B-Raf蛋白激活MAPK級聯反應，同時也激活MAPK蛋白家族的其他成員，所以Rap1可以在不同的細胞環境中促進或抑制其生長。C3G在癌癥中既有抑制癌癥的發生發展的作用，亦有促進癌細胞增殖作用[4-9]。在小鼠的成纖維細胞中，外源性的C3G的過表達通過介導sis、ras和v-raf等致癌基因的活化和共轉染來抑制其錨定非依賴性生長而作為抑癌基因[10]；卵巢癌中通過C3G/Rap1通路促進MMP-2、MMP-9的分泌,增強細胞浸潤能力[11]；在腎小球腎炎中增強腎小球上皮細胞的遷徙而抑制高侵襲性乳腺癌細胞[12-15]；宮頸癌中通過上游調控序列頻繁甲基化減少C3G表達促進細胞的增殖[16-20]；肝臟中低水平的C3G可能會促進肝癌細胞的遷移和侵襲[21]；在非小細胞肺癌中，內源性的C3G的上調及過表達可通過影響CRK-Rap1信號通路來發揮致癌作用[22]。

DNA甲基化是最早發現的基因表觀修飾方式之一，可參與癌癥的發生、發展及轉移[23]。檢索生物信息數據庫發現，在胃癌及癌旁組織中，C3G表達在癌組織中較正常組織高表達且具有統計學意義。有研究表明，在胃癌中基因組序列band CA-8主要表現為去甲基化，其定位于C3G的第一個內含子的酶切位點NotI上(GeneID:2889,chr 9q34.3)，腫瘤的發生發展與C3G內含子序列發生頻繁去甲基化有關。有研究表明，腫瘤的預防和治療可通過去甲基化恢復某些關鍵的抑癌基因或DNA修復基因的活性這一手段來達到[24-25]。因此，C3G蛋白的表達可能成為評估罹患胃癌風險及胃癌治療的指標。

結合既往研究可知，C3G對細胞的生長、分化、增殖、遷移等有一定的作用，但其在胃癌細胞中的具體作用尚不明確。本研究結合免疫組化的結果及臨床病理資料的分析，胃癌組織中C3G蛋白呈高表達，且C3G蛋白陽性表達病人生存時間明顯低于陰性表達組，分析影響胃癌病人預后的單因素、多因素COX風險比例回歸模型，C3G蛋白的表達為影響胃癌病人預后的獨立危險因素，與其他學者在卵巢癌及肝癌中的發現一致[4,7]。綜合研究結果表明，C3G蛋白可能參與腫瘤的分化、侵襲、遷徙等過程，并且能在一定程度上反應腫瘤的惡性程度。C3G的高表達可成為病人不良預后的因素之一，但具體如何參與了細胞的增殖、遷移等過程尚需進一步研究。

綜上所述，C3G在胃癌組織中表達較正常組織上調，對胃癌的發生發展具有一定的促進作用，其高表達病人預后生存周期較低。C3G可能成為胃癌的治療、預后監測指標之一。