碳酸飲料對雌鼠子宮發育及FSHR表達的影響

拜小強，袁肇方，牛宇輝，張向博，魏鎖成

(1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生物醫學研究中心，甘肅 蘭州 730030)

0 引言

碳酸飲料(Carbonated beverages,CB)為酸性飲品，主要成分為碳酸水、檸檬酸、糖和咖啡因.隨著消費量的增加，碳酸飲料已成為影響人體健康的重要因素之一[1].肥胖、II型糖尿病和代謝綜合征患病率的增加均與CB大量飲用有關[2].已有研究證實，咖啡因(包括咖啡、可可和巧克力)會對生殖產生不良影響，雌性Sprague-Dawley大鼠飲用可口可樂30、39和55周后體重增加[3].大量的研究調查了咖啡因攝入是否影響女性生育能力，但這些研究大多采用回顧性方法收集數據，結果是基于問卷調查、臨床病例前瞻性分析或流行病學觀察獲得的，結果難免存在偏差和出入[4-5].此前關于生育能力和碳酸飲料攝入量的定量評估報道較少，飲用碳酸飲料是否會導致女性不育的發生尚不明確[6-8]，相關實驗研究缺乏[9-10].本文旨在比較不同劑量可口可樂和百事可樂對子宮發育及促卵泡激素受體(FSHR)蛋白表達水平的影響，為進一步研究CBs對人類生殖疾病的作用及機制提供實驗依據.

1 材料和方法

1.1 實驗動物

28日齡昆明雌鼠150只，購自蘭州大學實驗動物中心[許可證號：SCXK(甘肅)2005-0007].體重20.44±2.45 g，隨機分為5組(n=30)：可口可樂1組(COC-1)、可口可樂2組(COC-2)、百事可樂1組(PEP-1)、百事可樂2組(PEP-2)和對照組(CG).將小鼠分組飼養于裝有自動飲水機的鼠籠中，環境條件：室溫22～24 ℃，相對濕度30%～50%，光照12 h/天，提供足量的飼料(購自蘭州泰華飼料有限公司)，經7 d飼養調整期后進行正式實驗.

1.2 實驗動物處理及樣品收集

5 L瓶裝的可口可樂和百事可樂購自蘭州市便利超市，保存于室溫(22±3 ℃).COC-1/COC-2、PEP-1/PEP-2和CG組小鼠分別自由飲用可口可樂、百事可樂和自來水，50%可樂由原裝可樂加入等體積自來水稀釋而成；100%可樂為原裝可樂未稀釋，見表1.

表1 雌鼠碳酸飲料飲用劑量

雌鼠飼養0、5、10、15、20和25 d時，每組隨機抓取5只用真空采血管眼眶采血，肌肉注射0.1 mg/kg甲苯噻嗪麻醉后，頸椎脫臼法處死，采集子宮稱重.血樣室溫下靜置2 h后3000×g離心20 min，-20 ℃保存.

1.3 子宮重量的稱量

雌鼠飼養0、5、10、15、20和25 d時采集子宮樣品，使用電子天平稱量.

1.4 子宮組織學觀察及UWT測量

用10%甲醛溶液固定子宮樣品，石蠟包埋后5 μm切片，蘇木精-伊紅染色后制得切片.在光學顯微鏡(Leica,Japan)和電子顯微鏡(JEOL,Tokyo,Japan)下觀察切片，拍攝顯微圖像.每個樣品取5個部位，每個部位取5個位點，每組共計檢測125個位點，使用Image Advanced 3.2和Image Pro-Plus 2.0 (MOTIC Company,Hong Kong,China)測量子宮壁厚度(Uterine wall thickness,UWT).

1.5 Western blot檢測FSHR蛋白表達

采用蛋白免疫印跡法(Western blot)分析可樂對雌鼠子宮FSHR蛋白表達水平的影響.子宮樣品在含有蛋白酶抑制劑(1 mmol/L PMSF)的裂解液(0.5% Nonidet P40,10 mmol/L Tris,pH 7.4,150 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,1mmol/L Na3VO4)中裂解.用10% SDS-PAGE凝膠蛋白電泳，轉移至PVDF膜上，在含1×TBS(10 mmol/L Tris,pH 7.5,100 mmol/L NaCl)和0.1%Tween-20的5%(w/v)脫脂奶粉中封閉2 h，加入兔抗FSHR多克隆抗體(Sigma，1∶200)和β-actin多克隆抗體(1∶1000)孵育混合液4 ℃過夜，然后加入二抗(1∶2000)孵育1 h.使用化學發光試劑(SuperSignal West Pico,Rockford,IL,USA)進行印跡，使用Quantity One軟件(Bio-Rad Company,Hercules,CA,USA)測定條帶圖像積分光密度值(IOD).FSHR蛋白的相對含量表示為FSHR與β-actin灰度值的比值.陰性對照組不加一抗，重復3次實驗.

1.6 ELISA檢測血清中FSH和LH含量

使用酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒檢測雌鼠血清中促卵泡激素(FSH)和促黃體激素(LH)濃度，按照產品說明書操作.用MK-3酶標儀(Rayto,USA)在450 nm波長下讀取各孔的吸光度值(OD)，重復3次實驗.FSH和LH檢測靈敏度分別為0.02 ng/mL和0.03 IU/L，組間變異系數小于4%，標準曲線的相關系數為0.9995.

1.7 統計孕鼠妊娠期、仔鼠體重和性別

統計孕鼠妊娠期和妊娠率，計算新生仔鼠數量和性別比，每天使用電子天平稱量新生小鼠的體重.

1.8 統計分析

2 結果

2.1 雌鼠體重及子宮重量

結果顯示，各組間體重無顯著性差異(數據略)，COC-2和PEP-2組子宮重量均低于CG組(見表2).從第15 d起，實驗小鼠的子宮重量均低于CG組.第20 d和25 d，COC-2和PEP-2子宮重量顯著低于CG組(P<0.05).結果表明，較長時間飲用高劑量可口可樂和百事可樂會減輕子宮重量.

表1 雌性小鼠的子宮重量(g)

2.2 子宮組織學結構

實驗結果顯示，對照組小鼠子宮結構清晰完整，子宮腺柱狀細胞排列整齊(圖1A)，子宮內膜完整，上皮細胞為分泌細胞；可口可樂組子宮腔輕微變窄，子宮壁輕度變薄(圖1B)，子宮內膜上皮細胞(EEC)變短，胞漿略有減少，子宮內膜皺褶；百事可樂組子宮腔輕微變窄，子宮壁和子宮內膜明顯變薄(圖1C)，子宮內膜上皮細胞變少且胞漿減少，子宮內膜皺褶，子宮腔及其腺體收縮，子宮腺體分散稀少.結果表明，可口可樂和百事可樂對小鼠子宮組織結構產生影響，從而抑制子宮發育.

注：A、B、C分別代表CG、COC-2和PEP-2組.

2.3 子宮壁厚度(UWT)

結果顯示，實驗組雌鼠UWT小于對照組，但各組間UWT值無顯著差異(數據略).結果表明，可口可樂和百事可樂對小鼠子宮壁厚度無顯著影響.

2.4 子宮FSHR蛋白表達水平

實驗組雌鼠FSHR蛋白表達水平較對照組均有不同程度的下降，COC-2和PEP-2組FSHR蛋白水平，在第20 d分別降低16.41%和17.20%，第25 d分別降低21.14%和22.80%(圖2)，即在第20 d和25 d，COC-2和PEP-2組FSHR蛋白水平顯著低于CG組(P<0.05).結果表明，可口可樂和百事可樂顯著抑制子宮中FSHR蛋白表達水平.

注：1～5分別為COC-1、COC-2、PEP-1、PEP-2和CG組.

注:*與CG比較，P<0.05.

2.5 血清FSH和LH濃度

實驗結果顯示，第25 d，COC-1、COC-2、PEP-1組血清FSH濃度較CG組分別降低27.44%、25.58%和26.86%(圖3)，均顯著低于CG組(P<0.05)；第10 d和15 d，COC-2、PEP-1、PEP-2組血清LH濃度均低于CG組，15 d時PEP-1、PEP-2組差異顯著(P<0.05)，表明可口可樂和百事可樂能降低血清FSH和LH濃度.

注:*與CG比較，P<0.05.

2.6 孕鼠妊娠期和仔鼠性別

結果顯示，COC-2和PEP-2組新生仔鼠平均出生數較COC-1組顯著減少(P<0.05)；COC-1、COC-2和PEP-2組仔鼠雄雌比例較CG組差異顯著(P<0.05)；COC-2組仔鼠存活率較CG組降低顯著(P<0.05)，PEP-2組仔鼠存活率較對照組降低極顯著(P<0.01).此外，PEP-2組仔鼠存活率較COC-1和PEP-1組降低顯著(P<0.05).各組間妊娠期無顯著性差異(見表3).表明可口可樂和百事可樂能降低每胎仔鼠數量和仔鼠周齡成活率，但對妊娠期無顯著影響.

表3 雌鼠妊娠期和新生仔鼠性別比例

2.7 新生仔鼠體重

實驗結果顯示，新生仔鼠出生體重(第0～5 d)無顯著差異，而在出生后第12 d，COC-2組和PEP-2組新生仔鼠體重較CG、COC-1和PEP-1組顯著增加(P<0.05).此外，COC-2組仔鼠體重在第7 d顯著大于CG和COC-1組(P<0.05).結果表明，高劑量的可口可樂和百事可樂能顯著促進新生仔鼠的生長發育.

表4 新生仔鼠的體重(g)

3 討論

有文獻證實碳酸飲料尤其是咖啡因影響生殖和產前產后發育[11].咖啡因的過量攝入是導致繁殖力下降的諸多因素之一，導致育齡女性的生育能力降低[11].流行病學研究調查了咖啡因攝入對生殖發育不利影響之間的聯系，攝入量較高的受試者比攝入量較低的受試者生育能力降低[12].然而，咖啡因攝入導致生育能力下降的報道結果卻有所不同[11]，咖啡因或含咖啡因的飲料影響生育的機制尚不明確，消費者對碳酸飲料與人類患病風險之間的關系知之甚少[12].

碳酸飲料會改變性激素水平(如雌二醇)，最終導致妊娠失敗[13].本研究發現，實驗組雌鼠血清FSH濃度在第5 d和第10 d略有增加，第25 d時COC-1、COC-2和PEP-1組血清FSH濃度均顯著低于CG組,第15 d時PEP-1、PEP-2組血清LH濃度顯著低于CG組.第20 d和25 d時COC-2和PEP-2組雌鼠子宮重量顯著低于CG組，子宮壁和宮腔輕微變窄，子宮內膜上皮細胞變短，子宮內膜皺褶.實驗組雌鼠子宮壁厚度(UWT值)在實驗范圍內低于對照組，PEP-2組子宮內膜上皮細胞變少.到目前為止，相關研究報道較少[13]，碳酸飲料(包括可口可樂和百事可樂)的準確影響效果仍有待進一步研究證實[10].

促卵泡激素(FSH)能促進腔前卵泡的增殖和分化，誘導卵泡生長和成熟[14].已有研究證實FSHR可在子宮中表達，但高劑量的可口可樂和百事可樂是否影響FSH分泌和FSHR表達尚不完全清楚[5,15].本實驗中所有實驗組雌鼠FSHR蛋白水平均降低，在第20 d和25 d時，COC-2和PEP-2組FSHR蛋白水平顯著低于對照組.結果表明，可口可樂和百事可樂能抑制小鼠子宮FSHR蛋白的表達水平.

懷孕期間攝入咖啡因會對胎兒生長產生潛在的不利影響，但卻與流行病學研究結果矛盾.一項流行病學研究表明，女性懷孕期間攝入咖啡因，嬰兒出生體重低或宮內發育遲緩[15].但在本實驗中，與對照組相比COC-2和PEP-2組新生仔鼠的體重在第7 d明顯增加，COC-2和PEP-2組新生仔鼠第12 d體重較CG、COC-1和PEP-1組差異顯著，這說明高劑量的可口可樂和百事可樂能促進新生仔鼠的生長.

綜上所述，長期飲用可口可樂和百事可樂會降低子宮重量，影響子宮組織結構，血清FSH和LH濃度及子宮FSHR蛋白表達水平降低，導致子宮發育欠佳，高劑量的可口可樂或百事可樂可促進新生仔鼠的生長發育.該研究結果為進一步研究可口可樂和百事可樂對人類子宮發育和生殖功能的影響及機制奠定基礎，為子宮疾病的治療提供實驗依據.