FSH受體抑制劑對卵巢發育及FSHR和ERβ表達水平研究

鞏轉娣，袁肇方,牛宇輝，張向博，3，魏鎖成，3

(1.西北民族大學 醫院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生物醫學研究中心，甘肅 蘭州 730030)

癌癥的早期診斷是提高患者生存率的關鍵因素[1].卵泡刺激素受體(Follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)的表達水平與卵巢癌，特別是上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，EOC)的發生密切相關[2].FSHR過度表達與EOC細胞中潛在致癌途徑的增加有關.因此，抑制FSHR過度表達可能減緩EOC的發生[1，4].研究FSHR在卵巢癌治療過程中水平變化可能會提供新的治療方案和診斷的準確性[3].雌激素受體β(Estrogen receptor β,ERβ)介導雌激素發揮生理作用.ERβ可以增強ERα介導的激素依賴性癌細胞的增殖[5],因此，ERβ的水平與卵巢癌發生相關[6].

FSHR結合抑制劑(FSHR binding inhibitor,FRBI)最初從綿羊和人的卵泡液中分離得來，是一種8肽[7].FRBI可阻斷FSH與FSHR的結合，并在受體水平改變FSH的作用.體內給予FRBI可抑制排卵，并引起小鼠卵泡閉鎖.前期研究認為FRBI可以調控綿羊卵丘細胞復合體(Cumulus-oocyte complexes,COCs)中FSHR和促黃體素受體 (luteinizing hormone receptor,LHR)的mRNA和蛋白表達水平，同時增加綿羊COCs雌二醇(Estradiol,E2)的產生[8].然而，關于FRBI對卵巢癌患者FSHR與ERβ水平及E2分泌的影響作用和機制鮮少報道[9].迄今為止，尚不清楚FRBI是否會影響與卵巢癌發生相關的FSHR和ERβ基因和蛋白的表達水平[7，10].基于此，本研究假設FSH受體結合抑制劑(FRBI)能夠影響卵巢發育，改變組織中FSHR和ERβ的表達水平.通過實驗研究，初步探明FRBI通過改變卵泡中FSHR和ERβ表達水平來抑制癌癥發生的作用與機制.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 FRBI(南京肽業生物技術有限公司合成),TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)，小鼠雌二醇ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)，引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成.

1.1.2 實驗動物 SPF級23～25日齡雌性小白鼠180 只，體質量(22.3±1.52) g[蘭州大學動物實驗中心，合格證號: SCXK (Gansu) 2005-0007].

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物處理 所有小鼠經過10天的實驗室適應期后，隨機分為FRBI處理組、FSH處理組和對照組(CG)(n=30).FRBI組小鼠再次分為FRBI-1，FRBI-2和FRBI-3，FRBI-4組.分別以10、20、30和40 mg/kg體重的劑量肌內注射FRBI(表1)，連續五天，每天1次.FSH組小鼠連續5天肌內注射10 IU FSH，每日1次，作為陽性對照組.對照組小鼠肌內注射0.2 mL生理鹽水，連續5天，每天1次，作為空白對照組.每天早上(上午8點至9點)進行注射.

表1 小鼠實驗分組設計

1.2.2 測量和樣本收集 每組分別于第0、7、10、15、20和30天經尾靜脈注射0.1 mg/kg二甲苯胺噻嗪麻醉后處死各5只小鼠.無菌收集卵巢，稱重卵巢重量.在光學顯微鏡下，計數每個卵巢中次級卵泡數(SF，直徑2～5 mm)，平均值由左右卵巢計算.同時在第0、7、10、15、20和30天收集血樣，血清分離后-20 ℃保存.

1.3 卵巢的測量

10%甲醛固定的卵巢，石蠟包埋，切片，并用H.E.染色.在光學顯微鏡下觀察切片，計數次級卵泡.采集卵巢顯微圖像.使用Images Advanced 3.2和Image Pro Plus 2.0分別測量卵巢皮質的厚度(ovarian cortex thickness，OCT)，次級卵泡的最大縱徑(maximum longitudinal diameter，MLD) 和 最 大 橫 徑 (maximum transverse diameter，MTD).

1.4 FSHR和ERβ mRNA的實時RT-PCR(qRT-PCR)

用TRizol法從卵巢中提取總RNA，試劑盒反轉錄成cDNA ，再分別進行qRT-PCR分析.

1.4.1 引物設計 根據Beacon Designer 7.0軟件設計FSHR特異性引物(NM_013523.3)和ERβ(NM_007956.4)以小鼠GAPDH(HM_043737.1 NM_008084.2)基因的表達作為內參基因[11].

用于qPCR的引物序列如下：FSHR (F: CGTCCTGATGAGCAAGTTTGG,R: TGGGCTGATTGACTTAGAGGG);ERβ (F: CTTGTGTGTGGACACTCCGT,R:AAGAAAGGCACAAGGCACGA),GAPDH (F: CTTCAACAGCGACACTCACTCT,R: CCACCACCCTGTTGCTGTA).

1.4.2 RNA提取及cDNA合成 根據產品使用說明，用TRIzol試劑提取卵巢樣品總RNA.用上標TM Ⅲ第一鏈合成系統逆轉錄PCR(RT-PCR)合成cDNA.應用Nanodrop分光光度計對cDNA進行定量分析，再用去離子水稀釋50倍，將其用作熒光定量RR-PCR(qPCR)的模板.

1.4.3 熒光定量RT-PCR(qPCR) GAPDH作內參基因ERβ和FSHR的相對定量采用2-ΔΔCt方法.

1.5 測定小鼠卵巢中ERβ和FSHR蛋白質

用Western blotting測定ERβ和FSHR蛋白在卵巢組織中的表達水平.將兔抗FSHR和ERβ多克隆抗體(1︰200)和β-肌動蛋白多克隆抗體(1︰1000)稀釋并在4 ℃孵育過夜，與適當的第二抗體孵育1小時(1︰2000)，加入免疫印跡化學發光試劑，顯影.用凝膠圖像分析儀掃描照片.用Quantity One 軟件分析每個條帶的吸光度值(A).FSHR條帶的吸光度與β-actin條帶吸光度值之比表示組織中 FSHR的相對含量.

1.6 測定血清雌二醇(E2)濃度

嚴格按照ELISA試劑盒的說明書進行操作，測定血清雌二醇(E2)濃度.標準曲線的相關系數為0.999 3,各組間的變異系數低于6%.

1.7 數據統計分析

統計分析采用SPSS 21.0軟件.五組的所有變量均符合單向方差分析(ANOVA)的假設.分析后的數據再進行兩兩差異檢驗，P<0.05為差異顯著.用Pearson進行相關性分析，以確定FRBI劑量與其他指標的相關性.

2 結果

2.1 卵巢皮質厚度(OCT)

與CG相比，FSH組的卵巢皮質厚度(OCT)增加(圖1).FRBI組的OCT比CG和FHS組減少.在第30天，FRBI-4組的OCT低于FSH組(P<0.05).結果表明，高劑量FRBI(40 mg/kg)可以抑制小鼠的卵巢發育.

圖1 卵泡雌激素受體結合抑制劑(FRBI)對小鼠卵巢皮質厚度的作用(×100)

2.2 卵巢次級卵泡的數目

表2 不同時間點的次級卵泡數

表2數據顯示，FSH組的次級卵泡數(SF)與CG相比增加，在第20天達到最大值(P<0.01).FRBI處理組的SF數量隨著FRBI劑量而逐漸下降.在第15天，FRBI-3和FRBI-4組的次級卵泡數(SF)顯著低于FSH組(P<0.05或P<0.01).表明較高劑量的FRBI(30和40 mg/kg)能夠減弱FSH對卵泡發育的促進作用，導致卵泡成熟不良.

2.3 次級卵泡的縱徑(MLD)和橫徑(MTD)

在整個實驗中，四個FRBI組的MLD與FSH組、CG相比，呈劑量依賴性降低(圖2).FRBI-4組的MLD在第20天和第30天顯著低于CG和FSH組(P<0.05).與CG比較，在第20天，FRBI-3和FRBI-4組的MLD減少率分別為24.11%和27.47%.MTD結果與MLD類似，FRBI各組同樣遞減.結果表明，較高劑量的FRBI(40 mg/kg)處理小鼠后，可以阻滯卵泡發育.

2.4 FSHR mRNA在卵巢中的表達水平

為了評價FRBI對小鼠卵巢中FSHR mRNA表達的影響，用qPCR檢測FSHR mRNA的水平.如圖3所示，四個FRBI處理組小鼠卵巢中FSHR mRNA水平呈劑量依賴性的逐漸下降.第15天，與對照組(CG)相比較，FRBI-1、FRBI-2、FRBI-3和FRBI-4的FSHR mRNA水平分別降低7.94%、27.78%(P<0.05)、29.37%(P<0.05)和43.65%(P<0.01).結果表明，大劑量FRBI給藥(30 mg/kg～40 mg/kg)可以抑制卵巢FSHR mRNA的表達.

2.5 ERβ和FSHR蛋白在卵巢中的表達水平

ERβ和FSHR蛋白在小鼠卵巢中表達見圖4.與CG相比，FSH組ERβ和FSHR蛋白水平升高.第15天FSH組ERβ和FSHR蛋白水平高于CG組(P<0.05).4個FRBI處理小鼠的ERβ和FSHR蛋白水平與CG和FSH組相比逐漸下降.FRBI-4的ERβ蛋白水平在第20天時小于CG(P<0.05)(見圖3).另外，FRBI-3和FRBI-4組ERβ蛋白水平在第10天后均低于FSH組(P<0.05或P<0.01).

在第10天、第15天和第20天，FRBI-4組的FSHR蛋白質水平低于CG.同時，FRBI-3和FRBI-4組的FSHR蛋白質水平顯著低于FSH組(P<0.05或P<0.01)(見圖5).結果顯示，較高劑量FRBI(30 mg/kg或40 mg/kg)可以抑制小鼠卵巢中ERβ和FSHR蛋白的表達水平.

2.6 血清雌二醇(E2)

隨著FRBI劑量的增加，FRBI處理組的血清E2濃度逐漸降低(表3)，特別是在第15天和第20天，FRBI-2、FRBI-3和FRBI-4的E2濃度組均顯著低于CG和FSH組(P<0.05或P<0.01).表明FRBI可以減少E2的合成與分泌.

表3 血清雌二醇濃度 (pg/mL)

2.7 Pearson相關性分析

如表4所示， Pearson相關性分析顯示，FRBI給藥劑量與所有其他檢測指標呈顯著負相關(P<0.05或P<0.01).然而，FSHR mRNA和ER蛋白的表達水平與OCT、MLD呈正相關(P<0.05).表明FRBI對卵巢和卵泡發育有明顯的抑制作用.

3 討論

FSHR主要在卵泡顆粒細胞中表達[8].FRBI阻斷FSH與FSHR的結合，在受體水平上改變了FSH的作用[8,12].但是目前關于人類和動物中FSHR表達水平和卵巢癌的資料很少[10,13].

本研究通過觀察不同劑量的FRBI對小鼠卵巢的作用，探討FRBI對小鼠卵巢組織中FSHR和ERβ表達的影響，初步闡明FRBI通過改變FSHR水平來抑制癌癥的療效和ERβ.研究發現，FRBI組的卵巢皮質厚度(OCT)與CG、FHS組相比減少.FRBI-4組的OCT在第30天時低于FSH組，FRBI-3和FRBI-4組的次級卵泡數(SF)小于FSH組.在第20天，FRBI-3和FRBI-4組次級卵泡的最大橫徑(MTD)比CG組降低了24.11%和27.47%.此外，Pearson相關分析表明，FRBI的劑量與卵巢皮質厚度(OCT)、次級卵泡(SF)、卵泡最大縱徑(MLD)、FSHR mRNAs和蛋白表達以及ERβ蛋白表達水平均呈負相關.因此，FRBI抑制卵泡的發育，導致次級卵泡數量減少[1,14].但是其作用機制還需要繼續深入探究.

FSHR過度表達促進EOC細胞的增殖，因此抑制FSHR過表達有利于抑制EOC的腫瘤發生和發展[4,14].初步研究表明，在綿羊COCs中FRBI促進了E2產生[9].據報道，ERβ及其亞細胞定位可能在卵巢癌的發病機制中起關鍵作用[15].越來越多的研究表明，ERβ不僅與卵巢癌的發病機制有關，而且還與治療反應有關[16-17].因此，卵巢癌細胞中的ERβ表達可能使該受體成為卵巢癌治療中的潛在靶標[13,18].

先前的研究表明，在卵巢癌患者和動物模型中已經顯示了ERβ表達與存活的正相關性[9，19].由于ERβ5過表達可通過FAK/c-Src活化增強卵巢癌細胞遷移、侵襲和增殖，ERβ的過表達抑制卵巢癌細胞的生長和遷移并誘導細胞凋亡[20].ERβ5是卵巢癌的潛在愈后指標和治療靶點[9].然而，關于ERβ在卵巢和卵巢癌中作用機制報道很少[19].

研究結果表明，高劑量的FRBI可以抑制卵巢FSHR和ERβ在基因和蛋白水平的表達.FRBI組中隨著FRBI劑量增加FSHR mRNA表達水平卻在逐漸下降.在第15天，FRBI-2，FRBI-3和FRBI-4中FSHR mRNA分別減少27.78%、29.37%和43.65%.與CG和FSH組相比，FRBI處理后的小鼠ERβ和FSHR蛋白水平逐漸降低.在第20天，FRBI-4組的ERβ蛋白水平小于CG組.因此，FRBI抑制卵巢組織中ERβ蛋白的過度表達，從而抑制了卵巢癌的癌變.我們的研究結果與初始報告相似[10-11].這些發現可能是FRBI在受體水平上干擾FSH-FSHR復合物[21]，這為研究抗癌治療提供了新思路.

卵巢癌是一種激素反應性癌癥，60%～100%的卵巢癌都表達雌激素受體(ERs).在卵巢癌患者中，E2的濃度通常比正常水平高100～1 000倍.E2濃度增加可以刺激卵巢上皮細胞的增生和惡性變化，導致卵巢的腫瘤發生[22-23].迄今為止，關于FRBI對卵巢卵泡中E2分泌影響的文獻鮮見[10,23].本研究表明，FRBI-2、FRBI-3和FRBI-4組的E2濃度均低于CG和FSH組，即FRBI可以降低小鼠E2合成與分泌，這與文獻報道相一致[23],其詳盡機理有待深入研究.

4 結論

FRBI可以減少小鼠卵巢皮質厚度(OCT)和次級卵泡數量，較高劑量的FRBI(30 mg/kg和40 mg/kg)可抑制卵巢和卵泡發育，降低卵巢內ERβ、FSHR mRNA和蛋白的表達水平，并抑制E2分泌.FRBI的劑量與卵巢皮質厚度、次級卵泡、卵泡最大縱徑、FSHR mRNAs和蛋白表達以及ERβ蛋白表達水平呈顯著負相關.我們的研究結果為FRBI的抗癌作用提供了一定的科學依據.