不同濃度纖維素酶菌劑處理對小麥、青稞和油菜黃貯體外發酵特性的影響

李 斌 旦增曲珍 白瑪央金 馬金英 金 濤

(西藏自治區農牧科學院畜牧獸醫研究所，拉薩 850009)

隨著我國畜牧業的快速發展，人畜爭糧現象日益嚴重，發展節糧型畜牧業是緩解這一矛盾的重要途徑。據報道，我國農作物秸稈2010年產量就已達8.4億t，但由于秸稈營養價值低且品質差的缺點，使秸稈在動物生產中的應用受到較大的限制[1]，要想提高其營養價值必須經過合理的加工[2]。目前，秸稈的生物處理方法包括青貯和黃貯，黃貯是依靠枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌和產纖維素菌等益生菌，通過厭氧發酵提高秸稈的營養價值和利用率，提高適口性，并且能夠長期保存[3-5]。

反芻動物瘤胃液中的微生物能夠分泌纖維素酶并降解纖維素[6-7]。Lee等[8]研究表明，稻草秸稈青貯時添加純培養瘤胃真菌能夠降低青貯飼料中酸性洗滌纖維(ADF)和中性洗滌纖維(NDF)含量，提高青貯飼料粗纖維的降解率。Guo等[9]研究發現，體外發酵飼糧中添加纖維素分解菌提高了產氣量及氨態氮(NH3-N)、總揮發性脂肪酸(TVFA)、乙酸和丙酸含量，提高了中性洗滌纖維降解率(NDFD)，促進了飼料的消化降解。本實驗室在西藏黃牛瘤胃中篩選出了1株高產纖維素酶菌株N30，與其他從西藏地區動物胃腸道中篩選得到的產纖維素酶菌株相比，高產纖維素酶菌株N30活性較高，且在更寬的溫度范圍內保持較高活性、溫度穩定性和pH穩定性[10]，但是該菌株是否能夠促進黃貯的體外發酵進而提高黃貯品質還是未知。因此，本試驗擬通過體外發酵法探究高產纖維素酶菌株N30處理對小麥、青稞和油菜黃貯發酵指標的綜合影響效果，為其在反芻動物中的高效利用提供理論依據和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 飼料和菌株來源

小麥、青稞和油菜秸稈取自西藏自治區拉薩市達孜縣塔杰鄉。纖維素分解菌為高產纖維素酶菌株N30，由西藏黃牛瘤胃液中篩選而得，具體篩選步驟參照張元慶等[11]的方法。菌液與30%甘油以1∶1比例混合，-20 ℃保存。對小麥、青稞和油菜秸稈進行實驗室小批量黃貯發酵，每種秸稈各發酵12袋，秸稈鍘切為2.5 cm的小段，裝入真空聚乙烯袋中，每袋500 g，將發酵用纖維素分解菌進行活化培養，配制成2種不同濃度的菌液，分別為1×1010和2×1010CFU/kg，均勻撒于秸稈上，秸稈的水分含量控制在65%～70%，壓實將空氣排出，最后用封口膜封口，室溫下發酵60 d。

1.1.2 瘤胃液供體動物

選用4只健康、體重(25.0±0.5) kg、安裝瘤胃瘺管的成年湘東黑山羊作為瘤胃液供體。飼糧按精粗比40∶60制成全混合日糧(TMR)，其組成及營養水平參照NRC(2007)山羊營養需要量進行配制，每天08:00和18:00各飼喂1次，自由飲水。

1.1.3 體外發酵

體外發酵液按照培養液與瘤胃液2∶1的比例配制而成[12]。體外發酵裝置由HZS-H型恒溫水浴搖床和容積為100 mL的玻璃注射器(最小刻度為1 mL)組成。注射器每次使用之前需洗凈、烘干，然后用少量液體石蠟涂在活塞筒的四周，以防漏氣，并可減少氣體產生過程中活塞向上移動的阻力。

1.2 試驗設計及測定指標

體外發酵飼料為小麥、青稞和油菜黃貯，統一過1 mm篩。每種發酵飼料分為3個組，分別為對照組、添加1×1010CFU/kg纖維素分解菌組(Ⅰ組)和添加2×1010CFU/kg纖維素分解菌組(Ⅱ組)。

對發酵小麥、青稞和油菜黃貯進行感官評定，具體方法參照青貯飼料質量評定標準[13]。

27個發酵管隨機分為9組，每組2個重復。在每個發酵管內裝200 mg發酵飼料和1 mL菌液，用平板計數法確定菌量。Ⅰ和Ⅱ組分別添加1 mL的1×1010和2×1010CFU/kg菌液，對照組中加入1 mL滅活的菌液，并迅速加入培養液至30 mL，進行體外發酵試驗。

于發酵2、4、8、12、24、48 h測定厭氧發酵瓶內氣壓，并按公式[y=(x-0.816)/0.805]換算成室溫標準氣壓下的氣體體積，計算產氣量，參照Wang等[14]提出的方法計算：

式中：GPt表示t時刻的累積產氣量(mL/g)；Vf表示潛在最大產氣量(mL/g)；k表產氣速率(h-1)；b表示形狀參數。下式同。

起始底物降解速率[FRO0，mmol/(g·h)]，即當t=0時的底物降解速率，計算公式參考Wang等[15-16]的模型，數學表達方程為：

發酵結束后，將注射器內全部培養物取出，并立即用pH計測定pH，然后將一部分培養物以3 500×g離心15 min，上清液分別裝入不同的離心管中，-20 ℃冷凍保存，待測NH3-N、微生物蛋白(MCP)和揮發性脂肪酸(VFA)含量；一部分發酵液過400目尼龍布后將殘渣全部轉移至石英坩堝中用熱蒸餾水反復沖洗，隨后置于105 ℃烘箱中烘干以測定干物質降解率(DMD)和NDFD。NH3-N含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定[17]，VFA(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸及異戊酸)含量使用氣相色譜儀(安捷倫7890A，美國)測定[18]，參照董曉玲等[19]的方法進行測定。MCP含量采用考馬斯亮藍法測定[20]，甲烷(CH4)產量于體外瘤胃發酵48 h時，使用氣相色譜儀測定。

1.3 統計分析

采用Excel 2010軟件對試驗數據進行計算和整理，采用SAS 9.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，對差異顯著項目進行多重比較，并采用Tukey法鑒定比較平均值之間的差異顯著性，以P<0.05作為差異顯著判斷標準，0.05

2 結 果

2.1 不同濃度纖維素酶菌劑處理對小麥、青稞和油菜黃貯化學成分的影響

由表1、表2和表3可知，Ⅰ組的小麥和青稞黃貯的感官評分顯著高于對照組(P<0.05)。Ⅰ和Ⅱ組的小麥、青稞和油菜黃貯的pH均顯著高于對照組(P<0.05)。Ⅰ和Ⅱ組的小麥和青稞黃貯的乳酸、乙酸和丙酸含量顯著高于對照組(P<0.05)，各組之間油菜黃貯的乳酸、乙酸和丙酸含量差異不顯著(P>0.05)。Ⅰ和Ⅱ組的小麥和青稞黃貯的NDF和ADF含量顯著低于對照組(P<0.05)。Ⅱ組的小麥、青稞和油菜黃貯的粗蛋白質含量顯著高于對照組(P<0.05)。Ⅰ和Ⅱ組的小麥黃貯的粗脂肪含量顯著高于對照組(P<0.05)。

表2 不同濃度纖維素酶菌劑處理對青稞黃貯化學成分的影響Table 2 Effects of different concentrations of cellulase agent treatment on chemical components of highland barley yellow storage

表3 不同濃度纖維素酶菌劑處理對油菜黃貯化學成分的影響Table 3 Effects of different concentrations of cellulase agent treatment on chemical components of rape yellow storage

2.2 不同濃度纖維素酶菌劑處理對小麥、青稞和油菜黃貯體外營養成分降解率的影響

由表4可知，Ⅰ和Ⅱ組的小麥和青稞黃貯的DMD顯著高于對照組(P<0.05)，各組之間油菜黃貯的DMD差異不顯著(P>0.05)。Ⅰ和Ⅱ組的小麥黃貯的NDFD顯著高于對照組(P<0.05)，Ⅰ組的青稞黃貯的NDFD顯著高于對照組和Ⅱ組(P<0.05)，各組之間油菜黃貯的NDFD差異不顯著(P>0.05)。

表4 不同濃度纖維素酶菌劑處理對小麥、青稞和油菜黃貯體外營養成分降解率的影響Table 4 Effects of different concentrations of cellulase agent treatment on nutrient degradation rates in vitro of wheat, highland barley and rape yellow storages %

2.3 不同濃度纖維素酶菌劑處理對小麥、青稞和油菜黃貯體外發酵參數的影響

由表5可知，Ⅰ和Ⅱ組的小麥黃貯的pH顯著低于對照組(P<0.05)，Ⅰ和Ⅱ組的青稞黃貯的pH有降低的趨勢(0.050.05)。Ⅰ和Ⅱ組的油菜黃貯的NH3-N含量顯著高于對照組(P<0.05)，各組之間小麥和青稞黃貯的NH3-N含量差異不顯著(P>0.05)。各組之間小麥、青稞和油菜黃貯的MCP含量均無顯著差異(P>0.05)。Ⅰ和Ⅱ組的小麥和青稞黃貯的TVFA含量顯著高于對照組(P<0.05)。Ⅱ組的小麥黃貯的丁酸含量顯著低于對照組和Ⅰ組(P<0.05)，對照組的青稞黃貯的丁酸含量顯著高于Ⅰ和Ⅱ組(P<0.05)；Ⅰ組的小麥黃貯的戊酸和異戊酸含量顯著低于對照組和Ⅱ組(P<0.05)；Ⅰ和Ⅱ組的油菜黃貯的乙酸/丙酸有增加趨勢(0.05

表5 不同濃度纖維素酶菌劑處理對小麥、青稞和油菜黃貯體外發酵參數的影響Table 5 Effects of different concentrations of cellulase agent treatment on in vitro fermentation parameters of wheat, highland barley and rape yellow storages

2.4 不同濃度纖維素酶菌劑處理對小麥、青稞和油菜黃貯體外發酵產氣特性的影響

由表6可知，Ⅰ和Ⅱ組的小麥和青稞黃貯的48 h總產氣量顯著高于對照組(P<0.05)，各組之間油菜秸稈的48 h總產氣量差異不顯著(P>0.05)。

表6 不同濃度纖維素酶菌劑處理對小麥、青稞和油菜黃貯體外發酵產氣特性的影響Table 6 Effects of different concentrations of cellulase agent treatment on in vitro fermentation gas production characteristics of wheat, highland barley and rape yellow storages

3 討 論

本研究結果表明，小麥、青稞和油菜黃貯添加纖維素分解菌提高了乳酸、乙酸含量及黃貯感官評分，降低了NDF和ADF含量，增加了粗蛋白質含量，提高了黃貯秸稈的營養價值和利用率。纖維素分解菌能快速水解細胞壁結構多糖，使之產生足量的葡萄糖，為乳酸菌的繁殖生長提供碳源，從而增加乳酸和VFA含量，降低纖維含量。小麥、青稞和油菜秸稈經黃貯及纖維素分解菌處理后，以小麥黃貯營養價值較高，其可能的原因是因為小麥秸稈中粗蛋白質含量高，粗纖維含量低，黃貯效果較好。孫娟娟等[21]和馬廣英等[22]研究發現，添加纖維素酶后，小麥和油菜黃貯的感官綜合評定分值顯著提高，NDF和ADF含量顯著降低，粗蛋白質含量顯著提高，這與本試驗研究結果一致。

一般認為瘤胃內產氣量的多少與飼糧的消化率呈正相關，產氣越多，發酵效果越好。產氣量是由于干物質的降解而產生的，一般生產中可以利用DMD來簡單地評定瘤胃的發酵效果。DMD越高，飼料中的營養物質的利用就越多，說明瘤胃的內環境越有利于瘤胃微生物的發酵[23]。本試驗發現，小麥和青稞黃貯添加纖維素分解菌提高了瘤胃產氣量，增加了DMD和NDFD。杜江華等[24]和李昊[25]的研究同樣發現，秸稈中添加纖維素分解菌，瘤胃產氣量顯著提高。

瘤胃pH是衡量瘤胃微生物發酵狀況的重要指標，可綜合反映微生物發酵活動及有機酸的代謝情況[26]。瘤胃pH的正常范圍一般在5.5～7.5。有研究表明，當瘤胃pH低于6.2時，纖維分解菌的生長將會受到抑制[27]。本試驗瘤胃pH維持在6.21～6.56，屬于正常范圍，說明添加纖維素分解菌沒有對人工瘤胃酸堿內環境造成不良影響。小麥黃貯添加纖維素分解菌組瘤胃pH顯著低于對照組，青稞黃貯添加纖維素分解菌組瘤胃pH也有降低的趨勢。其原因可能是由于試驗組添加了纖維素分解菌液，發酵較快，因此很快產出酸性物質，pH下降明顯，這與杜江華等[24]的研究結果一致，說明添加活菌制劑可以加快瘤胃內微生物的發酵。NH3-N的形成主要是由于瘤胃微生物對飼糧中的含氮化合物的分解，而瘤胃中的NH3-N含量主要取決于2個因素，一個是飼糧中氮的降解速率，另一個是微生物對于氨的利用[28]。本試驗中，油菜黃貯添加纖維素分解菌組的NH3-N含量較高，說明添加活菌制劑能夠提高瘤胃NH3-N含量，這與孫滿吉等[29]和杜江華[26]研究結果一致。這是由于添加活菌制劑后能夠增加瘤胃中微生物的活性與數量，從而導致瘤胃中含氮化合物的降解增加，進而提高瘤胃NH3-N含量。

添加纖維素分解菌能夠使瘤胃中的VFA含量增加[30]。本試驗結果表明，與對照組相比，Ⅰ和Ⅱ組的小麥和青稞黃貯的TVFA含量顯著提高；Ⅱ組的小麥黃貯的丁酸含量顯著降低，青稞黃貯的丁酸含量顯著降低；Ⅰ組的小麥黃貯的戊酸和異戊酸含量顯著降低。黃立敏[31]在奶牛體外發酵飼糧中添加纖維素分解菌顯著提高了乙酸、丙酸和TVFA含量。杜江華等[24]在體外發酵飼糧中添加纖維素分解菌和固氮菌混合液顯著提高了乙酸、丙酸和TVFA含量。孫滿吉等[29]研究發現，添加纖維素分解菌，瘤胃液中TVFA、乙酸含量顯著提高，而對丙酸、丁酸含量和乙酸/丙酸無顯著影響，這與本試驗結果部分存在差異，原因可能是由于發酵底物的不同及菌液添加濃度的差別造成的，且本試驗采用的是體外發酵的方法。當乙酸/丙酸小于3屬于丙酸型發酵，而乙酸/丙酸大于3為乙酸型發酵。本試驗中各組乙酸/丙酸都小于3，說明該發酵類型屬于丙酸型發酵。

本試驗中的各組甲烷產量均無顯著差異。杜江華等[24]研究發現，4×1011CFU/L菌液混合組甲烷產量明顯高于對照組。喬國華等[32]直接將纖維素分解菌飼喂奶牛，發現微生物培養物可以提高甲烷產量。甲烷產量提高的原因在于飼糧中添加活菌制劑后，發酵加快，導致產生的甲烷不能被利用。本試驗中，各組之間甲烷產量無顯著差異的原因可能是由于菌液添加濃度較低造成的。

4 結 論

① 添加纖維素分解菌N30可增加小麥、青稞和油菜黃貯的DMD、NDFD和產氣量，促進飼料的消化降解，增加TVFA含量，丁酸和戊酸含量有不同程度地下降。

② 添加纖維分解菌N30對小麥、青稞和油菜黃貯體外發酵有明顯促進作用，且添加濃度以2×1010CFU/kg為宜。