不同剩余采食量的蛋鴨盲腸微生物組成及多樣性研究

楊 速 白 天 操勇清 黃學濤 陳斌丹 王武強 沈軍達 田 勇 李國勤 陶爭榮 陳 黎 趙阿勇 盧立志 曾 濤*

(1.浙江師范大學化學與生命科學學院，金華 321004；2.浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所，杭州 310021；3.浙江農林大學動物科技學院，杭州 311300；4.甘肅農業大學動物科學技術學院，蘭州 730000；5.諸暨市國偉禽業發展有限公司，紹興 311800；6.縉云縣農業農村局，麗水 321400)

近年來，我國蛋鴨育種工作有些突破，但蛋鴨的飼料利用率相較于雞和肉鴨仍然較低，而飼料成本在現代家禽生產中約占總成本的70%[1]，因此研究有效提高蛋鴨飼料利用率的技術體系及其機制，對提升我國蛋鴨生產養殖水平和產業科技發展具有重要意義。Koch等[2]提出的剩余采食量(residual feed intake，RFI)是目前衡量家禽飼料利用率的理想選擇指標。RFI指維持機體代謝過程和生產所需的期望采食量與實際采食量的差值[3]。研究表明，RFI能通過有效的個體選擇進行改良[4-6]。Faure等[7]以RFI為選育指標，經過對大白豬6個世代的選育之后，平均日增重相同(760 g/d)，但低RFI組比高RFI組平均日采食量減少216 g/d，飼料轉化率提高11.7%。Bordas等[8]對產蛋雞的飼料利用率進行了17代選育后發現，低RFI組的孵化率比高RFI組高30%。研究發現，選擇低RFI的番鴨飼養至7周齡可提高飼料利用率[9]。本團隊前期研究發現，蛋鴨RFI與采食量(FI)、飼料轉化率呈極顯著的正相關，表明在蛋鴨育種中選擇低RFI的蛋鴨能夠提高飼料利用率[10-11]。

腸道微生物與宿主的相互作用所構成的腸道微生物系統越來越受到關注，腸道微生物對宿主的影響包括代謝、免疫和行為等[12-13]。其中，腸道微生物對家禽營養吸收的影響是畜牧學研究的熱點之一。家禽腸道較短，食糜排空快，但在盲腸中停留時間較長，以供微生物發酵[14]。與其他腸段相比，家禽盲腸中微生物數量最多，產生的非淀粉多糖酶可將小腸無法消化吸收的非淀粉多糖發酵成短鏈脂肪酸，對促進營養物質吸收和提高飼料轉化率至關重要[15-16]。除了可以發酵飼料中難以消化的成分，某些腸道微生物也可以通過產生抗炎代謝物促進腸道健康，保證腸道正常功能，從而提高營養物質的消化吸收[17]。對不同動物的大量研究表明，腸道微生物與飼料利用率存在相關性。在豬方面，高飼料利用率的豬腸道微生物有更多利用食物中多糖和蛋白質的能力，其可能通過發酵多糖產生揮發性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)改善腸道健康，進而提高豬的飼料利用率[18]。在反芻動物方面，Guan等[19]研究發現，高RFI和低RFI組牛瘤胃微生物菌群結構存在顯著差異；腸道菌群中的琥珀酸菌屬、優桿菌屬等與RFI相關，其可能的作用機理是通過參與VFA的合成與吸收，調節宿主的能量代謝，進而影響機體RFI[20]。在家禽方面，不同飼料利用率肉雞在6個分類水平上優勢菌群種類一致，但相對豐度存在差異[21]；不同產蛋率下肉雞腸道菌群存在差異，并進而影響肉雞繁殖性能[22]；在產蛋雞上，盲腸微生物多樣性較十二指腸和糞便微生物多樣性高，對飼料利用率發揮著重要作用[23]。這些研究結果表明，畜禽RFI與腸道微生物群落多樣性及菌群組成、功能存在一定的聯系。因此，本研究旨在通過比較不同RFI蛋鴨個體的盲腸微生物組成，篩選候選差異菌群，為今后通過調控腸道菌群提高蛋鴨飼料利用率提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和基礎飼糧

試驗選取400日齡的紹興鴨300只，由紹興市諸暨市國偉禽業紹興鴨國家級保種場提供。采用3層梯形式籠舍進行單籠飼養，每個籠位用隔板隔開，以避免因相互啄食飼料而造成試驗誤差?；A飼糧選用產蛋鴨高峰期顆粒狀配合飼料(蛋倍利)，購自上海香川飼料有限公司。預試期10 d，正試期60 d(410～470日齡)，期間紀錄每個個體的采食量、平均蛋重(EML)、初始體重(IBW)、終末體重(FBW)，并計算每個個體的增重(GW)和代謝體重(BW0.75)。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

1.2 RFI測定

RFI測定利用多元線性回歸方程計算個體RFI并排序，選取RFI最高和最低的各15只鴨，分別為高RFI組(HRFI組)和低RFI組(LRFI組)，屠宰后采集盲腸內容物，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

RFI模型如下：

RFI=FI-(μ+a×BW0.75+b×GW+c×EML)[24]。

式中：FI為采食量；μ為截距；a、b、c為偏回歸系數；BW0.75為代謝體重；GW為增重；EML為平均蛋重。

1.3 腸道微生物檢測

使用德國QIAGEN公司的QIAamp Fast DNA Stool Mini試劑盒提取盲腸微生物總DNA。經DNA質檢過后，HRFI組共提取到有效樣本13個，LRFI組共提取到有效樣本11個。以提取的基因組DNA為模板，根據測序區域選擇帶有barcode的特異引物，使用上游引物(F341：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和下游引物(R805：5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)對細菌V3+V4區進行PCR擴增。PCR擴增程序為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共28個循環；72 ℃延伸7 min。將PCR擴增所獲得的產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并對目標片段進行切膠回收，于-20 ℃保存。后續測序由浙江天科高新技術發展有限公司完成。本試驗采用QIIME2(2019.4)、R語言等軟件對盲腸微生物進行Alpha多樣性分析，采用主坐標分析(PCoA)、主成分分析(PCA)和無度量定標(MNDS)法進行Beta多樣性分析，采用STAMP軟件分析組間差異菌群。

1.4 數據統計分析

采用Excel 2019和SPSS 22.0對所有數據進行整理和統計分析，采用t檢驗和Wilcox秩和檢驗。試驗結果采用“平均值±標準誤”(mean±SE)表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同RFI蛋鴨生產性能比較

由表2可知，HRFI組RFI、采食量極顯著高于LRFI組(P<0.01)，2組之間RFI差值達到了63.35 g/d，采食量差值達到了57.00 g/d。HRFI組料蛋比極顯著高于LRFI組(P<0.01)。2組之間增重、平均蛋重、產蛋率和體重均無顯著差異(P>0.05)，說明RFI的高低對蛋鴨體重、增重、平均蛋重和產蛋率沒有顯著影響。

表2 不同RFI蛋鴨生產性能比較Table 2 Comparison of performance of laying ducks with different RFI

2.2 Alpha多樣性分析

2.2.1 稀釋曲線和相對豐度等級曲線

由圖1可知，稀釋曲線圖中，HRFI組各樣本稀釋曲線較LRFI組短且更平緩，說明LRFI組物種相對豐度較HRFI組高。相對豐度等級曲線圖中，LRFI組相對豐度等級曲線在垂直方向上較為平緩且在水平方向上跨度較大；HRFI組各樣品相對豐度等級曲線在垂直方向上與LRFI組差異不大，在水平方向上跨度均較小，說明LRFI組相對豐度等級較HRFI組高，但物種分布均勻度差異不大。

H：高剩余采食量組 HRFI group；L：低剩余采食量組 LRFI group。

2.2.2 Alpha多樣性指數分析

由圖2可知，LRFI組Chao1指數顯著高于HRFI組(P=0.018 9)，說明LRFI組在菌群豐富度上高于HRFI組；LRFI組Shannon指數顯著高于HRFI組(P=0.025 7)，說明LRFI組菌群多樣性高于HRFI組；HRFI組和LRFI組Simpson指數均高于0.95，并且LRFI組高于HRFI組(P>0.05)，說明HRFI組和LRFI組的組內菌群多樣性和均勻度均較高。

圖2 不同RFI組盲腸微生物Alpha多樣性Fig.2 Alpha diversity of cecal microorganisms of different RFI groups

2.2.3 Beta多樣性分析

由圖3可知，由PCoA圖可見，HRFI組與LRFI組的微生物群落分離明顯，表明2組樣本菌群結構存在差異，主坐標1占比55.57%，主坐標2占比13.25%；由PCA圖可見，主成分1占比12.17%，主成分2占比8.69%；由NMDS圖可見，落在<0.2內的點占絕大多數，表明數據分析可靠性高。

圖3 不同RFI組PCoA、PCA和NMDS圖Fig.3 PCoA, PCA and NMDS figures of different RFI groups

2.3 微生物群落結構分析

2.3.1 門水平上菌群結構

由圖4可知，在門水平上，LRFI組蛋鴨腸道優勢菌群為厚壁菌門(Firmicutes)，HRFI組優勢菌群為變形菌門(Proteobacteria)，而擬桿菌門(Bacteroidetes)在2組中差異較小。2組物種相對豐度排名前5的菌群包括Bacteroidetes(50.6%)、Firmicutes(31.43%)、Proteobacteria(7.17%)、梭桿菌門(Fusobacteria)(4.06%)和脫鐵桿菌門(Deferribacteres)(2.00%)。其中，HRFI組Proteobacteria、Fusobacteria、Deferribacteres和Bacteroidetes相對豐度較LRFI組高，分別高2.12%、1.53%、1.31%和0.99%；而LRFI組僅Firmicutes相對豐度較HRFI組高，高4.75%。

圖4 HRFI組和LRFI組門水平優勢菌群Fig.4 Dominant flora of HRFI group and LRFI group at phylum level

2.3.2 屬水平上菌群結構

根據操作分類單元(OTUs)結果在屬水平對2組排名前10的微生物菌屬進行分析。由圖5可知，2組相對豐度排名前10的微生物菌屬組成相同，包括擬桿菌屬(Bacteroides)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、普雷沃氏菌科_Ga6A1(Prevotellaceae_Ga6A1_group)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、理研菌科_RC9(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、厭氧螺菌屬(Anaerobiospirillum)、脫鐵桿菌屬(Mucispirillum)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、瘤胃菌科_UGG-014(Ruminococcaceae_UCG-014)和副桿菌屬(Parabacteroides)。其中，HRFI組Bacteroides、Faecalibacterium、Anaerobiospirillum、Mucispirillum和Fusobacterium相對豐度均高于LRFI組，分別高3.71%、2.68%、2.09%、1.81%和1.53%；而LRFI組其余5個菌屬總相對豐度比HRFI組高1.57%，其他未知微生物菌屬相對豐度比HRFI組高7.90%。

圖5 HRFI組和LRFI組屬水平上排名前10的微生物菌屬Fig.5 Top 10 microorganism genus in HRFI group and LRFI group at genus level

2.4 不同RFI個體盲腸菌群差異分析

為分析HRFI組和LRFI組的差異菌群，進行組間t檢驗。由圖6可知，在屬水平，共有18個差異菌群，其中HRFI組僅有支原體屬(Mycoplasma)相對豐度極顯著高于LRFI組(P<0.01)；LRFI組中，Rikenellaceae_RC9_gut_group、產糞甾醇真桿菌([Eubacterium]_coprostanoligenes_group)、瘤胃菌科_UGG-010(Ruminococcaceae_UCG-010)、巴氏桿菌(Barnesiella)、瘤胃球菌屬_2(Ruminococcus_2)、乳梭菌屬(Lachnoclostridium)、瘤胃菌科_NK4A214(Ruminococcaceae_NK4A214_group)、瘤胃菌科_UCG-009(Ruminococcaceae_UCG-009)、斯萊克氏菌屬(Olsenella)、艾伯森桿菌屬(Eisenbergiella)、互營球菌屬(Syntrophococcus)、艾諾瑪菌屬(Enorma)、大腸桿菌-至賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)、小紡錘狀菌屬(Fusibacter)相對豐度顯著高于HRFI組(P<0.05)，克里斯滕森菌科_R-7(Christensenellaceae_R-7_group)、顫桿菌克屬(Oribacterium)、乳頭桿屬(Papillibacter)相對豐度極顯著高于HRFI組(P<0.01)。

圖6 屬水平上HRFI組和LRFI組組間菌群差異分析Fig.6 Analysis of bacterial community differences between HRFI and LRFI groups at genus level

3 討 論

3.1 不同RFI對蛋鴨生產性能的影響

本研究顯示，HRFI組蛋鴨采食量、RFI和料蛋比均極顯著高于LRFI組，而RFI對蛋鴨體重、增重、平均蛋重、產蛋率均無顯著影響。之前在紹興鴨和縉云麻鴨上的研究表明，RFI與采食量呈極顯著正相關[10]，而在北京肉鴨上的研究表明，RFI與采食量、飼料轉化率呈中度正相關[25]，這與本研究結果一致。對奶牛的研究表明，RFI最低的個體比RFI最高的個體節約了15%的飼料[26]，而選育低RFI的肉牛也能達到顯著減少飼料消耗的目的[27]。對羊的研究表明，RFI與干物質采食量呈顯著正相關，而RFI對羊體重、平均日增重等無顯著影響[28]，這與本研究結果一致。

3.2 不同RFI對蛋鴨盲腸微生物多樣性的影響

大量研究表明，畜禽的生產性能、飼料利用率和RFI與腸道微生物的組成存在相關性。本研究將同一場地內相同飼養管理條件且遺傳背景相似的紹興鴨分成HRFI和LRFI組，通過比較盲腸微生物多樣性和差異菌群，嘗試在盲腸微生物與RFI之間建立聯系。對豬[29-31]和雞[21]腸道微生物與飼料轉化率的關聯研究表明，飼料轉化率高的個體Alpha多樣性更高或趨于更高。本研究中，豐富度曲線、Chao1指數、Shannon指數和Simpson指數均表明LRFI組菌群Alpha多樣性高于HRFI組，與之前的研究結果一致。

3.3 不同RFI對蛋鴨門水平上盲腸微生物結構的影響

本研究中，在門水平上，LRFI組蛋鴨腸道優勢菌群為Firmicutes，HRFI組優勢菌群為Proteobacteria，而Bacteroidetes在2組中差異較小。El等[32]研究表明，Firmicutes和Bacteroidetes為主要編碼碳水化合物活性酶的菌群。腸道內Firmicutes與Bacteroidetes的比例(F/B)會影響宿主從食物中獲取能量的能力[33]。對大鼠的研究表明，在食物誘導的肥胖個體中F/B更高[34]。肥胖人群中Bacteroidetes相對豐度高于較瘦人群，當持續減少攝入的熱量，體重逐漸降低，Firmicutes相對豐度逐漸減小[35]。Firmicutes是不同RFI豬群腸道的主要差異菌群[36]。Han等[37]研究了不同體重斷奶仔豬腸道菌群的差異，在體重較高的仔豬腸道中，Firmicutes對豐度高于體重較低的個體；相反，Bacteroidetes和Proteobacteria對豐度在體重較低的個體中更高。這與在人和哺乳動物上的研究結果相似，家禽盲腸中Firmicutes相對豐度與體增重[38]和產蛋性能[22]存在正相關。另一項研究表明，早期在雞上使用抗生素會減少Firmicutes相對豐度，增加Proteobacteria相對豐度；在后期，低Firmicutes相對豐度的個體T細胞免疫活性降低[38]，揭示了Firmicutes和Proteobacteria對宿主免疫功能的影響。

3.4 不同RFI對蛋鴨屬水平上盲腸微生物結構的影響

在屬水平上，HRFI組與LRFI組蛋鴨腸道菌群相對豐度排名前10的菌屬相同，其中LRFI組Rikenellaceae_RC9_gut_group、Phascolarctobacterium和Parabacteroides相對豐度高于HRFI組。Rikenellaceae是產蛋雞相對豐度最高的3個菌群之一[40]，同時也是肉雞[21]和豬[10]盲腸中的優勢菌群，可以促進飼糧中蛋白質和碳水化合物的分解[41]。對大鼠的研究表明，在飼糧中添加高水平的脂肪，Phascolarctobacterium和Parabacteroides相對豐度隨之升高，且二者的相對豐度可能與體增重、體脂率以及代謝水平的變化有關[42]。此外，Parabacteroides可以通過誘導抗炎因子的產生以及抑制炎癥因子的分泌減少腸道炎癥反應，維持腸道正常功能[17]。

3.5 不同RFI對蛋鴨盲腸微生物結構差異的影響

本研究中，HRFI組和LRFI組蛋鴨存在18個差異菌群，其中HRFI組僅Mycoplasma相對豐度顯著高于LRFI。之前的研究顯示，Mycoplasma將碳水化合物作為主要能量物質，且在正常飼喂條件下哺乳動物腸道中很少見Mycoplasma[43]，豬糞便中Mycoplasma相對豐度與丁酸含量呈正相關[29]，膳食纖維組仔豬腸道菌群中Mycoplasma相對相對豐度顯著降低，表明Mycoplasma可能與宿主競爭性利用碳水化合物，且不能幫助代謝不易消化吸收的膳食纖維，進而影響宿主飼料利用率。其余17個差異菌群中12個為厚壁菌門，2個為擬桿菌門。其中厚壁菌門的[Eubacterium]_coprostanoligenes_group[30,44]、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)[30,42]、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)[36]和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)[45]對促進宿主消化吸收營養物質或提高飼料利用率有積極作用。

4 結 論

LRFI組蛋鴨盲腸微生物多樣性較高，2組菌群結構存在差異。門水平上，LRFI組蛋鴨盲腸優勢菌群為Firmicutes，HRFI組優勢菌群為Proteobacteria；屬水平上，LRFI組Christensenellaceae_R-7_group、Oribacterium、Papillibacter等17個菌群相對豐度高于HRFI組，而HRFI組僅Mycoplasma相對豐度高于LRFI組。