鼠李糖乳桿菌對早期斷奶成華黑仔豬生長性能、免疫性能和腸道菌群的影響

朱佳文 徐麒麟,2 蘇志鵬 劉瀚揚 陳亞迎 葉思齊 楊 雪 雷春龍 鄭江蓉 許禎瑩*

(1.成都市農林科學院，成都 611130；2.樂山市市中區農業農村局，樂山 614000；3.四川德康農牧食品集團股份有限公司，成都 610200；4.西南大學動物醫學院，重慶 400700)

新生仔豬由于免疫系統不成熟，很容易受到感染。飼喂新生仔豬益生菌可以對仔豬腸道菌群發育及其免疫系統產生短期或長期的影響，從而引起仔豬生長和免疫性能的改變。新生仔豬的腸道菌群最初是由母豬和周圍環境建立。腸道菌群對動物的免疫性能非常重要，而益生菌作為飼料添加劑不僅可以促進宿主腸道微生物的平衡[1]，還可以通過占據腸道微生物的結合位點或通過釋放有機酸或產生抗生素樣化合物來抵抗有害菌群的定植[2]。飼喂母豬益生菌可以提高母豬產仔數、體重以及降低腹瀉率[3]。Hayakawa等[4]研究發現，飼喂母豬和仔豬益生菌可以提高母豬繁殖性能，降低斷奶后仔豬腹瀉發生率和改善腸道組織病理變化。動物飼糧中常常添加乳酸菌作為益生菌來提高動物生產水平。研究表明，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)能顯著抑制大腸桿菌和沙門氏菌生長，促進斷奶仔豬小腸絨毛發育，改善腸道形態，提高斷奶仔豬平均日增重和飼料轉化率[5]。乳酸菌還能影響機體的免疫性能，機體抗氧化能力及免疫性能與功能性的德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)、Lactobacillusformicilis、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)和黏膜乳桿菌(Lactobacillusmucosae)呈正相關，而與敏捷乳桿菌(Lactobacillusagilis)和龐氏乳桿菌(Lactobacilluspontis)呈負相關，添加乳酸菌復合物可以優化仔豬腸道菌群組成，減輕斷奶應激，提高生長性能[6]。然而，關于鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)作為益生菌添加到早期斷奶仔豬飼糧中的報道還非常少。因此，本研究旨在研究飼糧中添加鼠李糖乳桿菌對早期斷奶成華黑仔豬生長性能、免疫性能和腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株、動物和試驗設計

本研究使用的鼠李糖乳桿菌為商品化益生菌，活菌數為5×1011CFU/g。仔豬(成華黑豬，本地品種)來自四川省成都市邛崍市嘉林生態農場。試驗選用32頭體重為(7.54±0.19) kg的28日齡斷奶成華黑仔豬，隨機分為2組，每組4個重復，每個重復4頭仔豬。對照組飼喂基礎飼糧，其組成及營養水平見表1；鼠李糖乳桿菌組在基礎飼糧中添加5.56 mg/kg鼠李糖乳桿菌，使每千克飼糧活菌數達到2.78×109CFU。仔豬飼養在完全封閉的豬圈內，自由采食。根據豬場的日常操作，正常進行免疫、驅蟲、消毒和管理等程序。試驗預試期7 d，正試期28 d。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

1.2 指標測定及方法

1.2.1 生長性能指標

在試驗開始和結束時對仔豬進行稱重，整個試驗期間記錄采食量，計算平均日增重、平均日采食量和肉料比。

1.2.2 免疫性能指標

試驗結束時，采用前腔靜脈采血法用真空管收集對照組和鼠李糖乳桿菌組所有仔豬血液10 mL，3 000 r/min離心15 min，收集上清液并儲存在-80 ℃冰箱中。血清生化指標：血清總蛋白(TP)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和葡萄糖(GLU)含量采用購自南京建成生物工程研究所的試劑盒測定。血清抗氧化指標：血清超氧化物歧化酶(SOD)活性和總抗氧化能力(T-AOC)采用購自北京奇松生物科技有限公司的試劑盒測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用購自南京建成生物工程研究所的試劑盒測定。血清免疫指標：血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-2(IL-2)、補體3(C3)、干擾素-γ(IFN-γ)和免疫球蛋白G(IgG)含量采用購自北京奇松生物科技有限公司的試劑盒測定。測定方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.3 盲腸內容物樣品采集

試驗結束時，每個重復任意選取2頭仔豬，注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg BW)麻醉后處死。用75%酒精擦拭所需腸道后結扎盲腸，將盲腸內容物擠入5 mL無菌EP管中，封口后立即放入液氮中。盲腸內容物樣品小心轉移至實驗室在-80 ℃冰箱中保存，用于后續腸道菌群分析。

1.2.4 腸道菌群16S rDNA基因的高通量測序

仔豬盲腸內容物樣品送到上海融享生物科技有限公司進行微生物多樣性分析。提取仔豬盲腸內容物總DNA后，用V3～V4引物擴增16S rDNA保守區域，并對產物進行純化、定量和均一化形成測序文庫。建好的文庫先進行文庫質檢，質檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500進行測序，利用雙末端測序法，構建小片段庫。通過對reads拼接過濾，操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)聚類，并進行物種注釋及豐度分析，揭示樣品的物種構成。序列之間的相似性高于97%定義為1個OTU，每個OTU對應1種代表序列。將具有代表性的OTU序列與微生物參考數據庫進行比較，得到每個OTU對應的物種分類信息以及從門到屬水平各樣品的群落組成情況[7]。

1.3 數據統計分析

采用Student’st檢驗進行組間數據差異顯著性分析，結果用“平均值±標準差”表示，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌對早期斷奶成華黑仔豬生長性能的影響

由表2可知，與對照組相比，鼠李糖乳桿菌組早期斷奶成華黑仔豬末重和平均日采食量無顯著差異(P>0.05)，平均日增重和肉料比顯著提高(P<0.05)。結果表明，飼糧添加鼠李糖乳桿菌能夠提高早期斷奶成華黑仔豬的生長性能。

表2 鼠李糖乳桿菌對早期斷奶成華黑仔豬生長性能的影響Table 2 Effects of Lactobacillus rhamnosus on growth performance of early weaned Chenghua black piglets

2.2 鼠李糖乳桿菌對早期斷奶成華黑仔豬免疫性能的影響

由表3可知，在血清生化指標中，與對照組相比，鼠李糖乳桿菌組早期斷奶成華黑仔豬血清TP含量極顯著提高(P<0.01)，其他血清生化指標無顯著差異(P>0.05)；在血清抗氧化指標中，與對照組相比，鼠李糖乳桿菌組血清CAT和SOD活性極顯著提高(P<0.01)，血清T-AOC顯著提高(P<0.05)；在血清免疫指標中，與對照組相比，鼠李糖乳桿菌組血清TNF-α和IgG含量極顯著提高(P<0.01)，血清IL-2和C3含量顯著提高(P<0.05)，血清IFN-γ含量無顯著差異(P>0.05)。

表3 鼠李糖乳桿菌對早期斷奶仔豬成華黑仔豬免疫性能的影響Table 3 Effects of Lactobacillus rhamnosus on immune performance of early weaned Chenghua black piglets

2.3 鼠李糖乳桿菌對早期斷奶成華黑仔豬腸道菌群的影響

為了評估鼠李糖乳桿菌對早期斷奶成華黑仔豬腸道菌群的影響，采集對照組和鼠李糖乳桿菌組63日齡仔豬盲腸內容物進行測序分析，共獲得151 919對reads，經過濾后得到119 293 clean tags；每組樣品至少產生26 663 clean tags，平均獲得29 823 clean tags。對照組和鼠李糖乳桿菌組斷奶仔豬盲腸內容物微生物16S rDNA保守片段平均片段長度分別為467.0和465.5 bp。早期斷奶成華黑仔豬盲腸內容物菌群OTU數目分布情況見圖1。由圖可知，對照組和鼠李糖乳桿菌組分別包含229和243個OTU，其中共同OTU數目為220個，對照組特有OTU數目為9個，鼠李糖乳桿菌組特有OTU數目為23個。

圖1 早期斷奶成華黑仔豬盲腸內容物菌群OTU數目分布情況Fig.1 Distribution of OTU number in cecal contents of early weaned Chenghua black piglets

早期斷奶成華黑仔豬盲腸內容物菌群物種分布見圖2。由圖可知，從門水平上分析，厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)3大類細菌為對照組和鼠李糖乳桿菌組斷奶仔豬盲腸內容物菌群的優勢菌門，且厚壁菌門和擬桿菌門占比最多，變形菌門次之。具體而言，對照組盲腸內容物厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門的相對豐度分別為45.43%、49.10%和4.47 %，鼠李糖乳桿菌組盲腸內容物厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門的相對豐度分別為45.16%、43.09%和10.47%。由表4可知，從屬水平上分析，對照組盲腸內容物乳桿菌屬(Lactobacillus)、Alloprevotella、普雷沃氏菌屬9(Prevotella_9)和埃希氏菌-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)的相對豐度分別為0.18%、6.25%、32.05%和2.11%，而鼠李糖乳桿菌組盲腸內容物相應菌屬的相對豐度分別為3.96%、23.71%、14.57%和0.61%，其中鼠李糖乳桿菌組盲腸內容物乳桿菌屬和Alloprevotella相對豐度較對照組分別增加了3.78和17.46個百分點，即細菌相對數量分別提高了21.00倍和2.79倍，而普雷沃氏菌屬9和大腸桿菌-志賀氏菌屬相對豐度較對照組分別降低了54.54%和70.62%。

表4 早期斷奶成華黑仔豬盲腸內容物菌群屬水平差異細菌的相對豐度Table 4 Relative abundance of differential bacteria at genus level in cecal contents of early weaned Chenghua black piglets %

Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Proteobacteria：變形菌門：Euryarchaeota：廣古菌門；Actinobacteria：放線菌門；Cyanobacteria：藍藻菌門；Fusobacteria：梭桿菌門；Saccharibacteria：單糖菌門；Spirochaetae：螺旋菌門；Nitrospinae：硝棘菌門；Peptoclostridium：梭菌屬；Clostridium_sensu_stricto_1：狹義梭菌屬1：Escherichia-Shigella：埃希氏菌-志賀氏菌屬；Prevotella_9：普雷沃氏菌屬9；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；Lactobacillus：乳桿菌屬；Actinobacillus：放線桿菌屬；Faecalibacterium：糞桿菌屬；Others：其他；Unclassified：未分類。

3 討 論

3.1 鼠李糖乳桿菌對早期斷奶成華黑仔豬生長性能和免疫性能的影響

鼠李糖乳桿菌是一種耐胃酸、耐膽汁并能有效定植在人體和動物腸道的乳酸菌屬益生菌，因此被應用于人和動物生長發育、腸胃調理和腹瀉病的預防等方面。在畜牧業中，鼠李糖乳桿菌能夠改善雞的生長性能和肉品質[8]，還能影響健康豬只糞便微生物的組成和功能[9]。在本研究中，飼糧添加鼠李糖乳桿菌顯著提高早期斷奶成華黑仔豬平均日增重和肉料比，說明鼠李糖乳桿菌可以提高斷奶仔豬生長性能，這與Bocourt等[10]研究發現鼠李糖乳桿菌能夠提高仔豬平均日增重的結果一致。同時，本試驗中，飼糧添加鼠李糖乳桿菌顯著提高斷奶仔豬血清TP、TNF-α、IL-2、C3和IgG含量、CAT和SOD活性以及T-AOC，說明鼠李糖乳桿菌可以提高斷奶仔豬的免疫性能。血清TP含量反映了動物機體的營養狀態和蛋白質利用率，TP含量的升高暗示了蛋白質吸收能力增加。血清CAT、SOD活性和T-AOC是血清抗氧化能力的重要指標，其在機體的內臟組織器官中發揮著重要的抗氧化功能，可以清除機體內多余的自由基。有研究報道，益生菌枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)可以提高機體抗氧化酶的活性[11]，提高動物免疫能力。動物的氧化應激易引發消化道疾病，導致動物生長發育緩慢、生產性能低下、飼料轉化率降低以及抵抗疾病的能力下降等[12]，而本研究中，上述抗氧化指標的增強說明飼喂了添加鼠李糖乳桿菌飼糧的仔豬具有更強的抗氧化能力，更能抵御機體內的有害物質。TNF-α是腫瘤壞死因子的一種類型，由活化的單核巨噬細胞產生，其作用是刺激T和B淋巴細胞協同作用，降低機體炎癥反應，殺死機體的腫瘤細胞[13]。本研究中，鼠李糖乳桿菌組斷奶仔豬血清TNF-α含量顯著提高，這與Gastillo等[14]研究發現新生仔豬口服乳酸菌能夠上調TNF-α分泌的結果一致，說明鼠李糖乳桿菌能夠調控仔豬黏膜抗炎細胞因子基因的表達。IL-2由活化的T淋巴細胞產生，可以促進T淋巴細胞分泌細胞因子等，增強機體免疫能力[15]。IgG是血清中主要的抗體成分，補體是存在于人或動物體液中的一組與免疫有關且具有酶活性的球蛋白，C3是補體系統中含量最多、最重要的一個組分，是補體激活的經典途徑、旁路途徑以及甘露聚糖結合凝集素途徑三者的交匯點，有著重要的生物學功能，如抗病毒、殺菌以及免疫調節作用[16]，本研究發現，鼠李糖乳桿菌組斷奶仔豬血清IgG和C3含量顯著提高，說明鼠李糖乳桿菌能夠有效提高仔豬機體免疫性能，對機體抵抗外來病菌的侵襲有很好的防御作用。這可能是由于鼠李糖乳桿菌作為抗原進入動物體內，刺激腸道，通過抗原遞呈給T淋巴細胞，誘導IL-2釋放，分泌大量IgG來介導體液免疫，使動物獲得免疫保護力。

3.2 鼠李糖乳桿菌對早期斷奶成華黑仔豬腸道菌群的影響

在本研究中，厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門為對照組和鼠李糖乳桿菌組早期斷奶成華黑仔豬盲腸內容物菌群的優勢菌門。然而，在屬水平上，2組的菌群構成發生了變化，特別是乳桿菌屬、Alloprovotella、普雷沃氏菌屬9和埃希氏菌-志賀氏菌屬，其中，與對照組相比，鼠李糖乳桿菌組盲腸內容物乳桿菌屬相對豐度明顯提高。近幾年，乳桿菌屬被公認為是對人類和動物機體有益的常用益生菌。斷奶仔豬盲腸內容乳桿菌屬相對豐度提高可能是由于飼糧中添加鼠李糖乳桿菌后，增加了其在腸道菌群中的比例。普雷沃氏菌屬9屬于擬桿菌門中非常重要的菌屬，研究發現，隨著仔豬日齡增加，腸道中普雷沃氏菌屬9的相對豐度會逐漸降低[17]。本研究中，鼠李糖乳桿菌組盲腸內容物普雷沃氏菌屬9相對豐度較對照組有所降低，可能是由于鼠李糖乳桿菌促進了同齡仔豬的腸道發育。Alloprevotella亦屬于擬桿菌門，可以產生短鏈脂肪酸，而短鏈脂肪酸在胃腸道中具有調控脂肪儲備的作用[18]，本研究中，鼠李糖乳桿菌組斷奶仔豬生長性能的提高也可能受到了Alloprevotella相對豐度提高的間接調控。變形桿菌門包含了很多腸道致病菌，如埃希氏菌-志賀氏菌屬能夠引起腹瀉。與對照組比較，鼠李糖乳桿菌組盲腸內容物埃希氏菌-志賀氏菌屬相對豐度明顯降低，可能是由于鼠李糖桿抑制了致病微生物的生長。另外，鼠李糖乳桿菌組盲腸內容乳桿菌屬相對豐度的提高也可能會搶占腸道菌群的空間，降低pH，從而讓乳桿菌屬更易生長，而埃希氏菌-志賀氏菌屬更難生存。有文獻也證實了有些乳桿菌屬益生菌具有抑制腸道致病菌的能力，如鼠李糖乳桿菌DR20和乳酸雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)DR10對產毒素大腸桿菌(Escherichiacoli)有拮抗作用[19]；Lactobacillusfrumenti能夠提高腸道中有益微生物[Lactobacillusfrumenti、格氏乳桿菌 (Lactobacillusgasseri)和碲糖酵母(Kazachstaniatelluris)]的相對豐度，同時降低致病菌脫硫脫硫弧菌(Desulfovibriodesulfuricans)和腐殖假絲酵母(Candidahumilis)的相對豐度[20]。這可能是由于鼠李糖乳桿菌能夠穩定黏附在豬腸上皮細胞上[16]，并抑制腸道內埃希氏菌-志賀氏菌屬等病原菌的黏附；也可能是由于添加鼠李糖乳桿菌導致仔豬腸道內乳桿菌屬和Alloprevotella相對豐度提高，埃希氏菌-志賀氏菌屬相對豐度降低，從而間接影響到豬的生長和免疫性能。

4 結 論

綜上所述，飼糧添加鼠李糖乳桿菌能夠提高早期斷奶成華黑仔豬平均日增重和肉料比，提高血清抗氧化能力和機體免疫性能，提高盲腸內容物乳桿菌屬和Alloprevotella相對豐度，降低盲腸內容物埃希氏菌-志賀氏菌屬相對豐度，改善腸道菌群結構，促進腸道健康，從而提高其生長性能和免疫性能。