添加纖維素酶和淀粉對象草青貯發酵品質的影響

李 莉 吳漢葵 解祥學* 趙國強 何家俊 胡志超 楊昕澗 吳 浩

(1.廣東溢多利生物科技股份有限公司，珠海 519060；2.廣東燕塘乳業股份有限公司，廣州 510000；3.中國農業大學動物科技學院，北京 100193)

象草原產于非洲、亞洲南部和澳大利亞等地，是熱帶、亞熱帶地區普遍栽培的多年生高產暖季型牧草，現今在我國南方各省大面積種植利用[1]。由于象草產量高、生長速度快，并且夏季剩余較多，而南方地區多雨、潮濕，難以進行干草調制，青貯得到廣泛應用。但是象草水溶性碳水化合物含量低，粗纖維素含量高，且表現為多莖、莖空、粗硬的物理結構，青貯過程中不易壓實，有較多的空氣包含其中，容易造成呼吸作用及好氧性微生物活動時間延長，使乳酸菌發酵底物不足，青貯難以獲得成功[2-4]。因此，在象草青貯過程中經常使用添加劑進行發酵。

纖維素酶能夠把飼料中的纖維素降解成為可消化吸收的還原糖，提升飼料的營養價值，是一種綠色飼料添加劑[5]?，F今，纖維素酶在反芻動物生產應用中取得了良好的生產效益和經濟效益。象草中的碳水化合物含量比較低，在青貯發酵時不能為乳酸菌繁殖提供足夠的營養物質，導致發酵品質變壞[6]。青貯過程中添加淀粉可增加發酵底物，加速青貯飼料的發酵進程。

目前對象草飼料化利用的研究較少，對添加纖維素酶對象草青貯發酵品質影響的研究報道有限，對添加纖維素酶和淀粉對象草青貯發酵品質和微生物多樣性影響的研究更是未見報道。因此，本試驗以象草為研究對象，探究在象草青貯過程中添加纖維素酶和淀粉對象草青貯發酵品質和微生物多樣性的影響，為合理青貯象草提供數據支持和技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

將種植于廣東溢多利溢園牧場試驗地完熟期的象草于2020年4月18日刈割，用鍘草機切成2～3 cm長，莖葉充分混合均勻后即為青貯原料。象草青貯前的化學成分見表1。

表1 象草青貯前化學成分Table 1 Chemical composition of napier grassbefore ensiling

1.2 試驗設計

試驗采用完全隨機設計，設置3個組，分別為對照組、添加纖維素酶組(纖維素酶制劑添加量為0.05%，試驗Ⅰ組)，混合添加纖維素酶與淀粉組(纖維素酶制劑添加量為0.05%，淀粉添加量為2%，試驗Ⅱ組)。各添加劑的添加量均為鮮重基礎，纖維素酶制劑中纖維素酶活性為120 000 U/g。各組青貯原料在室溫[(24±2) ℃]條件下貯藏，在發酵第30天結束后打開小型青貯窖取樣進行分析，每組貯藏3袋作為3個重復，共9袋。

1.3 試驗方法

1.3.1 象草青貯飼料的制作

將全株象草切成2～3 cm后稱取100 g，快速裝填并壓實，于110 mL的小型青貯窖中密封后，置于室溫條件下保存，在青貯發酵第30天打開，取樣進行分析。

1.3.2 樣品預處理

青貯窖打開后，取出全部青貯飼料混勻，稱取10 g用來測定微生物(乳酸菌、酵母菌、霉菌)數量。另外稱取25 g放入300 mL的廣口三角瓶，加入225 mL的蒸餾水，充分攪拌后密封，在4 ℃的冰箱內浸提24 h，期間振蕩搖勻數次。然后用過濾漏斗通過2層紗布和濾紙過濾，保存濾液(-20 ℃冷凍保存)待測。濾液用來測定pH以及乳酸、氨態氮和揮發性脂肪酸濃度。將剩余的部分青貯飼料收集起來烘干，稱重粉碎，測定干物質、總氮、粗脂肪、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維以及水溶性碳水化合物含量。部分剩余的、未烘干青貯飼料裝入無菌的50 mL凍存試管中，保存于-20 ℃冰箱中，用于測定青貯飼料中微生物多樣性。

1.4 測定方法

1.4.1 營養成分含量和發酵品質指標測定

干物質含量采用將青貯飼料放置于105 ℃的烘箱中烘2 h，然后將烘箱調至65 ℃的恒溫繼續烘直至恒重的方法[7]測定；總氮含量通過凱氏定氮法[8]測定；粗脂肪含量采用索氏抽提法測定；參照Van Soest等[9]的方法，使用纖維分析儀(ANKOM A200i，北京安科博瑞科技有限公司)測定中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量。采用pHS-3C精密pH計(上海精密科學儀器有限公司)對青貯飼料樣品處理后的過濾液直接測定pH；采用苯酚-次氯酸鈉比色法[10]和硫酸-蒽酮比色法[11]分別測定氨態氮和水溶性碳水化合物含量；參照Cao等[12]的方法，使用LC-100高效液相色譜儀測定乳酸、揮發性脂肪酸含量；采用弗氏評分法[13]對青貯飼料發酵品質等級進行評定。

1.4.2 微生物數量分析

采用平板計數法對象草青貯中乳酸菌、酵母菌、霉菌進行計數[13]。將待測樣品稀釋適當倍數后產生計數菌落，并用每克鮮重中菌落形成單位的對數[lg(CFU/g FM)]表示菌落數。取10 g青貯飼料置于裝有90 mL無菌蒸餾水的容量瓶中，充分混勻，并進行連續梯度稀釋。每份浸提液取1 mL，滴加到提前預備的培養基上。乳酸菌使用MRS Agar培養基(青島海博生物科技有限公司)，置于厭氧培養箱(37 ℃)培養48 h，計數菌落數。酵母菌和霉菌使用Potato Dextrose Agar培養基(通過菌落外觀和細胞形態區分酵母菌與霉菌)置于恒溫培養箱(30 ℃)培養48 h，計數菌落數。

1.4.3 微生物多樣性分析

使用試劑盒提取象草青貯中的微生物組總DNA，利用前引物和后引物獲得細菌16S rRNA基因V3～V4高變異區。擴增產物回收純化，基于Illumina NovaSeq測序平臺對該文庫進行雙末端測序[14]。Illumina NovaSeq測序及結果分析均由北京諾禾致源生物科技股份有限公司協助完成。

1.5 數據統計與分析

數據先用Excel 2007軟件進行初步統計整理，再用SAS 9.2軟件對各不同指標的數據進行統計分析。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。利用Novomagic在線平臺分析微生物相對豐度，并進行操作分類單元(OTU)分析、alpha多樣性分析、主成分分析(PCA)、物種組成分析等。

2 結果與分析

2.1 添加纖維素酶和淀粉對象草青貯營養成分含量的影響

由表2可知，象草青貯第30天，各組間干物質和粗蛋白質含量差異不顯著(P>0.05)。試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組的水溶性碳水化合物含量均高于對照組，比對照組分別提高了37.95%(P>0.05)、106.10%(P<0.01)，且試驗試驗Ⅱ組還極顯著高于試驗Ⅰ組(P<0.01)。試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量均低于對照組，且試驗Ⅱ組顯著低于對照組(P<0.05)。

表2 添加纖維素酶和淀粉對象草青貯營養成分含量的影響Table 2 Effects of adding cellulase and starch on nutrient contents of napier grass silage

2.2 添加纖維素酶和淀粉對象草青貯發酵品質的影響

由表3可知，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組的pH均極顯著低于對照組(P<0.01)，2個試驗組之間差異不顯著(P>0.05)。試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組的乳酸、乙酸含量高于對照組，同時試驗Ⅱ組的乳酸、乙酸含量高于試驗Ⅰ組，但各組之間差異不顯著(P>0.05)。所有樣品均未檢測出丁酸。試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組的乳酸/乙酸值比對照組分別提高了23.42%、37.59%，但各組之間差異不顯著(P>0.05)。各組間的氨態氮/總氮值差異不顯著(P>0.05)。試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組的弗氏評分顯著高于對照組(P<0.05)，對照組的等級為尚可，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組的等級為良好。

表3 添加纖維素酶和淀粉對象草青貯發酵品質的影響Table 3 Effects of adding cellulase and starch on fermentation quality of napier grass silage

2.3 添加纖維素酶和淀粉對象草青貯微生物數量的影響

由表4可知，象草青貯第30天，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組的乳酸菌數量比對照組分別提高了2.39%、3.27%，但各組之間差異不顯著(P>0.05)。所有樣品均未檢出酵母菌和霉菌。

表4 添加纖維素酶和淀粉對象草青貯微生物數量的影響Table 4 Effects of adding cellulase and starch on microbial population of napier grass silage lg(CFU/g FM)

2.4 添加纖維素酶和淀粉對象草青貯微生物多樣性的影響

2.4.1 象草青貯細菌OTU基礎分析結果

由圖1可知，3個組象草青貯細菌共有的OTU數為58個，對照組特有OTU數為29個，試驗Ⅰ組特有OTU數為27個，試驗Ⅱ組特有OTU數為52個。對照組、試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組的象草青貯細菌OTU數分別為203、201和226個。

圖1 象草青貯細菌OTU分布Venn圖Fig.1 Venn diagram of bacterial OTU distribution of napier grass silage

2.4.2 象草青貯微生物alpha多樣性分析結果

表5中數據為象草青貯開封后的微生物alpha多樣性指數。覆蓋度用于表示本次測序相對于整體樣本的覆蓋程度，數值越高，覆蓋程度越高。所有組的覆蓋度均大于0.999，說明測序深度基本全面覆蓋微生物的核心組成?？傮w來看，試驗Ⅱ組的Chao1指數、ACE指數均高于對照組和試驗Ⅰ組，說明試驗Ⅱ組與對照組、試驗Ⅰ組相比，樣本菌群豐度較高，多樣性水平也相對較高。試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組的Shannon指數、Simpson指數均高于對照組。

表5 象草青貯微生物alpha多樣性指數Table 5 Microbial alpha diversity indexes of napier grass silage

2.4.3 象草青貯微生物群落PCA結果

基于OTU水平的PCA結果見圖2。2個點之間的距離越近，表明這個2個樣本之間的微生物群落結構相似度越高。由圖可知，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)對結果差異的貢獻度分別為34.15%、24.39%。不同組的青貯樣品能夠較明顯的區分開，說明不同組青貯樣品中微生物群落的組成存在一定的差異。

圖2 PCA的三維排序圖Fig.2 3D sorting chart of PCA

2.4.4 基于門水平的微生物群落結構分析結果

圖3顯示了在門水平上象草青貯微生物菌群結構的變化，其他菌門中包括擬桿菌門(Bacteroidetes)、棲熱鏈球菌門(Deinococcus-Thermus)和軟皮菌門(Tenericutes)等。其中，占絕對優勢的厚壁菌門的相對豐度由高到低的順序為試驗Ⅱ組>試驗Ⅰ組>對照組。除厚壁菌門外，對照組和試驗Ⅱ組的優勢菌門為藍菌門(Cyanobacteria)，試驗Ⅰ組為變形菌門(Proteobacteria)。

Firmicutes：厚壁菌門；Cyanobacteria：藍菌門；Proteobacteria：變形菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Tenericutes：軟皮菌門；Actinobacteria：放線菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Gemmatimonadetes：芽單胞菌門；Deinococcus-Thermus：棲熱鏈球菌門；Chloroflexl：綠彎菌門；Others：其他。

2.4.5 基于屬水平的微生物群落結構分析結果

圖4顯示了在屬水平上象草青貯微生物菌群結構的變化，各組占絕對優勢地位的菌屬均為乳桿菌屬。除乳桿菌屬外，對照組的優勢菌屬為未分類的藍細菌屬，其次為乳球菌屬；試驗Ⅰ組的優勢菌屬為未分類的藍細菌屬、乳球菌屬、魏斯氏菌屬和泛生菌屬；試驗Ⅱ組的優勢菌屬依次為未分類的藍細菌屬、乳球菌屬和魏斯氏菌屬。

Lactobacillus：乳桿菌屬；Unclassified-Cyanobacteria：未分類的藍細菌門；Lactococcus：乳球菌屬；Weissella：魏斯氏菌屬；Pantoea:泛生菌屬；Acinetobacter：不動桿菌屬；Citrobacter:檸檬酸桿菌屬；Pedlococcus：戊酸乳球菌屬；Serratia:沙雷氏菌屬；Enterococcus：腸球菌屬；Others：其他。

3 討 論

3.1 添加纖維素酶和淀粉對象草青貯營養成分含量的影響

在青貯發酵過程中，各組的干物質損失比較少，干物質含量差異不顯著。這主要是由于本試驗采用小型青貯窖模擬生產實踐，青貯窖快速密封，且密封效果好，青貯象草無流汁損失。有研究表明，可溶性碳水化合物含量會影響乳酸菌發酵速度，過低將減慢乳酸菌發酵進程，不能夠及時降低青貯pH和有效抑制有害微生物的活動[15]。賈燕霞等[1]試驗發現，隨著酶添加量的增加，水溶性碳水化合物含量增加。Jones[16]添加淀粉到黑麥草青貯中，發現青貯飼料的水溶性碳水化合物含量提高3%～4%，提高了青貯飼料的發酵品質。本試驗中，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組的水溶性碳水化合物含量均高于對照組，且試驗Ⅱ組的水溶性碳水化合物含量極顯著高于對照組和試驗Ⅰ組，青貯質量得到提高。

中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量降低可以認為在青貯過程中分解了部分纖維素、半纖維素，釋放出一定的水溶性碳水化合物，能夠給乳酸菌提供更多的發酵底物，提高青貯飼料的發酵品質[17]。國內學者研究表明，纖維素酶能降低青貯飼料的中性洗滌纖維與酸性洗滌纖維含量，提高青貯質量[18-19]。本試驗中，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量均低于對照組，且試驗Ⅱ組顯著低于對照組。這說明試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組的青貯質量都得到提高，且試驗Ⅱ組的青貯質量較好。

3.2 添加纖維素酶和淀粉對象草青貯發酵品質的影響

pH是評判青貯發酵品質的指標之一，反映了總酸的含量[20]。品質優良的青貯飼料的pH在3.8～4.2[21]。當青貯飼料品質較優時，它的值越小，其酸度就越高，營養物質損失就越少[22]。周昕等[23]在食葉草青貯中添加糖蜜，使得pH低于對照組；朱旺生等[24]研究表明，皇竹草青貯中添加纖維素酶能有效地降低pH。本試驗中，雖然所有組pH都較高，但試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組的pH均極顯著低于對照組。

乳酸和揮發性脂肪酸含量是評價青貯質量好壞的重要指標[25]。據Catchpoole等[26]報道，品質優良的青貯飼料的乳酸含量介于30～130 g/kg DM。研究表明，纖維素酶能顯著提高大黍青貯的乳酸含量[19-20]。周昕等[22]研究表明，在食葉草青貯中添加糖蜜可增加發酵底物，促進乳酸發酵。乙酸主要是由異質型乳酸菌產生，具有較強的抗真菌能力[27]。Alli等[28]研究顯示，與對照組相比，添加糖蜜的苜蓿青貯pH較低、乳酸和乙酸含量高，青貯品質較好。本試驗中，乳酸、乙酸、乳酸/乙酸值由高到低的順序為試驗Ⅱ組>試驗Ⅰ組>對照組，與上述試驗結果一致，說明添加纖維素酶，尤其在添加纖維素酶基礎上添加淀粉可以達到更好的青貯效果，這可能與淀粉水解成為微生物發酵底物有關。丁酸是腐敗菌和酪酸菌分解蛋白質、葡萄糖和乳酸的產物，一般認為優質青貯飼料的丁酸含量應低于1%[29-30]。黃媛等[31]在構樹青貯中添加糖蜜和纖維素酶，未檢測出丁酸。在本試驗中，沒有檢測出丁酸，說明象草青貯過程中有害微生物被抑制。

賈燕霞等[1]在象草青貯中添加酶制劑后提高了象草青貯的發酵品質。王永新等[32]研究表明，將鮮汁2%的甘蔗糖漿添加到狼尾草中進行青貯，青貯飼料的發酵品質得到明顯提高。本試驗中，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組的弗氏評分顯著高于對照組；對照組的弗氏等級為尚可，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組的等級為良好，說明試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組象草青貯的發酵品質均得到了提高。

3.3 添加纖維素酶和淀粉對象草青貯微生物數量的影響

纖維素酶能水解植物細胞壁，將青貯原料中部分結構性碳水化合物降解為單糖或雙糖，這為乳酸菌的繁殖提供了充足的可供利用底物[29]。榮輝等[33]報道，在象草青貯中添加糖蜜，促進了象草中結構性碳水化合物的降解。靳思玉等[34]添加糖蜜增加了青貯飼料表面可溶性糖含量，使乳酸菌繁殖加速。本試驗中，乳酸菌數量由高到低順序為試驗Ⅱ組>試驗Ⅰ組>對照組，與上述試驗結果一致。酵母菌在青貯過程中是無利的，它會引起青貯飼料傾向于發生二次發酵；霉菌是導致青貯飼料有氧腐敗的主要有害微生物，如果青貯密封不嚴或者沒有壓實，沒有達到厭氧環境，霉菌就會大量生長，分解纖維素和植物細胞壁組分，分解糖和乳酸，改變營養物質構成[35]。周昕等[23]在食葉草青貯中添加糖蜜，所有樣品均未檢出霉菌。本試驗中，所有樣品均未檢出酵母菌和霉菌，說明所有組象草青貯發酵良好。

3.4 添加纖維素酶和淀粉對象草青貯微生物多樣性的影響

青貯過程是一個復雜的微生物共生的體系，多種微生物共同參與，因此對青貯飼料微生物的群落組成進行研究具有重要意義[36]。OTU是人為給定品系、種和屬等某一分類單元設置的同一標志，對來自于同一環境的所有樣品序列進行合并，并將相似性大于97%的序列歸類為一個OTU[37]。alpha多樣性是指特定環境或生態系統內的多樣性，主要用來反映物種豐富度和均勻度及測序深度[38]。Chao1指數用于判斷群落物種的豐富度，其值越大表示物種種類越多；ACE指數用于估算還有多少未被發現的物種，其值越大，樣本的真實物種種類越多[39]。本試驗中，試驗Ⅱ組特有OTU數、Chao1指數和ACE指數均高于對照組和試驗Ⅰ組，說明該組樣本菌群豐度和多樣性水平都得到提高。Shannon指數主要用于描述OTU出現的紊亂及不確定性，不確定性越高，其越高。Simpson指數越高表示樣本物種多樣性越豐富。周俊華等[37]在甘蔗尾葉青貯中添加微生物添加劑，試驗組的Shannon指數、Simpson指數均高于對照組。本試驗中，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組的Shannon指數、Simpson指數均高于對照組，這說明試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組的樣本物種多樣性比較豐富。

厚壁菌門在大多數青貯飼料中占主導地位，多數為革蘭氏陽性，可以產生芽孢抵抗脫水和極端環境，很多芽孢桿菌可以降解纖維素、淀粉、蛋白質等多種大分子化合物[40]。乳桿菌屬是厚壁菌門主要的菌屬之一，直接影響青貯品質[41]。Eikmeyer等[42]研究報道，在飼草青貯過程中，青貯第14天和第58天厚壁菌門的相對豐度分別為86.00%和87.00%。劉蓓一等[43]研究報道，在大麥青貯期，厚壁菌門是絕對優勢菌門。黃媛等[31]在構樹青貯中添加糖蜜和纖維素酶后提高了厚壁菌門的相對豐度。本試驗結果顯示，厚壁菌門是3組象草青貯中的絕對優勢菌門，且由高到低的順序為試驗Ⅱ組>試驗Ⅰ組>對照組，這與以上試驗結果一致。乳酸菌是制作優良青貯飼料的主要微生物，具有抑制腐敗菌及其他有害菌繁殖的作用，進而對青貯飼料起到防腐保鮮的作用[36]，魏斯氏菌屬也屬于乳酸菌。Dellaglio等[44]研究認為魏斯氏菌屬在發酵初期起重要作用。豆艷麗等[45]研究報道，全株玉米青貯過程中乳酸桿菌屬和魏斯氏屬是優勢菌屬。本試驗中，各組均未檢測到青貯飼料的重要腐敗菌(革蘭氏陽性芽孢桿菌屬和梭菌屬)，各組占絕對優勢地位的菌屬均為乳桿菌屬，試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組的魏斯氏菌屬相對豐度高于對照組?；陂T和屬水平的分析結果說明，試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組象草青貯的發酵品質得到了提升，尤其在添加纖維酶和淀粉的試驗Ⅱ組，其微生物多樣性表現地更豐富，可能主要和增加了象草的微生物發酵底物有關。

4 結 論

本試驗條件下，單獨添加纖維素酶和混合添加纖維素酶與淀粉均能夠提高象草青貯的營養成分含量、發酵品質、乳酸菌數量、微生物多樣性、厚壁菌門和魏斯氏菌屬的相對豐度，且混合添加纖維素與淀粉時提高作用更明顯。綜上所述，混合添加纖維素酶與淀粉對象草青貯發酵品質和微生物多樣性的提高效果較佳。