低鹽脅迫下飼料中添加α-硫辛酸對凡納濱對蝦生長、抗氧化能力及腸道健康的影響

符振強 董揚帆 湯上上 周 利 徐 暢 李二超

(海南大學海洋學院，海南省水產種業工程研究中心，海南省熱帶水生生物技術重點實驗室，海口 570228)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)是全球三大養殖對蝦品種之一，因具有廣鹽性特征，能夠適應0.5‰～50.0‰的鹽度環境，因此近年淡化養殖在內陸不斷推廣[1-2]。但低鹽度養殖環境對凡納濱對蝦的生長[3]、肝胰腺免疫[4]、腸道菌群[5]等方面均會造成較大的負面影響。同時，不同水體條件下的凡納濱對蝦腸道菌群也會發生相應的變化，腸道微生物與機體的營養代謝、健康狀態和疾病爆發有著重要聯系[6]。而低鹽度養殖水體環境的菌群與正常海水之間本就存在差異[7]。在對蝦養殖中，添加飼料添加劑是減輕低鹽脅迫負面影響的一種有效方法[8]。為了滿足現代水產綠色發展的需要，通常會在水產飼料中添加功能性飼料添加劑，以此提高水產動物的生長性能以及抗病能力，并能夠使宿主腸道菌群達到最佳的平衡狀態，從而維持水產經濟物種的健康，提高養殖產量[9]。α-硫辛酸(α-lipoic acid，α-LA)是一類天然的二硫醇抗氧化劑，又被稱為硫辛酸或辛酸，其在線粒體脫氫酶反應中起著至關重要的作用，除了能幫助細胞將葡萄糖轉換為能量以外，還可起到解毒、抵御皮膚發炎和穩定血糖等作用[10]。此外，α-LA作為一種強抗氧化劑，能夠清除體內外的活性氮(RNS)和活性氧(ROS)[11]。有研究證實，一定劑量的α-LA對機體是安全、無毒的，因此可以用作飼養動物的飼料添加劑[12-13]。到目前為止，α-LA在家養禽畜中得到廣泛的應用，如雞[14-16]、豬[17]、羊[18]等；同時也在水產養殖動物如魚類[19-20]、蟹類[21-22]和貝類[23]中應用并獲得良好的效果。盡管α-LA是一種通用抗氧化劑，但其對凡納濱對蝦的生理生化及腸道菌群影響的研究仍然十分有限，且對于凡納濱對蝦在抵抗低鹽脅迫中的應用研究尚屬空白。因此，本研究旨在探討α-LA對低鹽度(3‰)環境飼養的凡納濱對蝦生長、抗氧化能力和腸道菌群的影響，以期為內陸低鹽度凡納濱對蝦養殖提供改善生長性能和減輕環境脅迫壓力的實用解決方案，提高凡納濱對蝦淡水養殖的產量和規模。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

α-LA，純度>99%。參照Li等[24]，配制以魚粉和豆粕作為蛋白質源，以魚油、豆油、膽固醇和卵磷脂作為脂肪源，以小麥淀粉作為糖源的4種等氮等能、粗蛋白質含量約為35%、粗脂肪含量約為9%的試驗飼料。試驗飼料組成見表1，營養水平見Li等[24]。飼料原料經粉碎機粉碎后過80目網篩，將篩下物按飼料組成進行配比并逐級充分混合均勻，在基礎飼料組成水平的基礎上分別稱量0、0.3、0.6、1.2 g/kg的α-LA并加入到飼料的油脂中，用玻璃棒攪拌均勻溶解后，倒入混勻的飼料原料中制成4種不同α-LA含量的試驗飼料。與油脂混合后過20目網篩，將油脂團打散后混合均勻，按照30%的比例添加雙蒸水，通過攪拌器攪拌均勻后通過雙螺旋壓條機(F-26，廣東華工光機電科技有限公司)擠壓成條，自然通風處陰干至水分約為10%后，粉碎過20、16和12目的網篩，制成不同直徑的沉性顆粒料，標記分裝于自封袋，放入-20 ℃冰箱儲存備用。

表1 試驗飼料組成(干物質基礎)Table 1 Composition of experimental diets (DM basis) g/kg

續表1原料Ingredientsα-LA含量 α-LA content/(g/kg)00.30.61.2礦物質預混料 Mineral premix2)5.0 5.0 5.0 5.0 羧甲基纖維素鈉 Sodium carboxymethyl cellulose30.0 30.0 30.0 30.0 纖維素 Cellulose 11.2 10.9 10.6 10.0 α-硫辛酸 α-lipoic acid0.3 0.6 1.2 碳酸鈣 CaCO3 20.0 20.0 20.0 20.0 合計 Total1 000.01 000.01 000.01 000.0

1.2 試驗設計與飼養管理

凡納濱對蝦取自海南省儋州市某幼蝦繁育基地。試驗開始前對凡納濱對蝦幼蝦進行為期2周的暫養，暫養期間將對蝦分成2部分，鹽度均保持在25‰。通過添加充分曝氣、紫外消毒的淡水到過濾消毒過的天然海水中，逐漸降低養殖水體鹽度，最終將對蝦的養殖水體鹽度分別控制為25‰和3‰。

選取體質健壯、初始體重為(0.061±0.005) g的幼蝦1 000尾，分別按照暫養水體鹽度將幼蝦隨機平均分配到20個玻璃養殖箱(110 cm×80 cm×40 cm)內，其中4個養殖箱水體鹽度為25‰，16個養殖箱水體鹽度為3‰。試驗設置2個對照組(25‰海水對照組和3‰低鹽對照組)和3‰鹽度下3個α-LA添加水平(0.3、0.6、1.2 g/kg)的試驗組，每組設置4個重復，每個重復50尾幼蝦。

養殖過程中，25‰海水對照組和3‰低鹽對照組全程投喂基礎飼料，另外3個試驗組在3‰水體鹽度下分別投喂含0.3、0.6、1.2 g/kg α-LA的試驗飼料。試驗期間，每日于08：00、14：00、20：00以5%對蝦重量定量投喂，殘餌和糞便及時用虹吸管進行清理。試驗周期為8周，每天定量更換1/3養殖水體，使水體保持pH為7.5～7.9，水溫為26～30 ℃，溶解氧含量≥6.4 mg/L，總氨氮含量<0.02 mg/L。

1.3 樣品采集

養殖結束后，對蝦禁食24 h后進行冰浴麻醉，統計各個養殖箱內對蝦數量、體長和體重，用以計算存活率(survival rate，SR)、增重率(weight gain rate，WGR)、和肥滿度(condition factor，CF)；快速分離對蝦肝胰腺組織并進行稱重，以計算肝體指數(hepatosomatic index，HSI)；肝胰腺和腸道組織放入凍存管中經液氮速凍，儲存于-80 ℃超低溫冰箱，用以生化分析及腸道菌群結構分析。同時，于每個養殖箱中隨機抽取3只對蝦，收集中腸組織，使用4%多聚甲醛溶液固定，以備制作腸道組織切片，觀察腸道組織學響應。

1.4 指標測定

1.4.1 生長性能

增重率、肝體指數、肥滿度和存活率采用下列公式進行計算：

增重率(%)=100×(最終體重-
初始體重)/初始體重；
肝體指數(%)=100×濕肝胰腺重量/體重；
肥滿度(g/cm3)=體重/體長3；
存活率(%)=100×最終對蝦數量/初始對蝦數量。

1.4.2 抗氧化能力

隨機挑選凡納濱對蝦的肝胰腺樣本(n=4)，按比例(組織重量∶生理鹽水=1∶9)進行組織勻漿，分別檢測超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)、過氧化氫酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)含量，以上指標均采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒，按說明書所述方法進行測定。

1.4.3 腸道微生物分析

測序得到的原始數據，經拼接、過濾掉干擾序列后得到有效數據。將樣本區分后以97%的一致性進行操作分類單元(OTU)聚類和物種分類分析，并對其代表序列進行物種注釋。基于OTU進行alpha多樣性分析，并對不同樣本進行beta多樣性分析。使用生物信息學軟件包PICRUSt預測腸道菌群的功能譜，并使用京都基因與基因組百科全書(KEGG)進行注釋。

1.5 統計分析

運用Excel 2019進行數據整理，運用SPSS 26.0統計軟件對3‰低鹽度對比下的數據作單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏多重比較變量檢驗；25‰鹽度與3‰鹽度處理對比的數據采用t檢驗(ttest)進行分析，試驗結果用“平均值±標準誤(mean±SE)”表示，P<0.05表示顯著差異，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 低鹽脅迫下飼料中添加α-LA對凡納濱對蝦生長性能的影響

如圖1所示，3‰低鹽對照組的存活率極顯著低于25‰海水對照組(P<0.01)，顯著低于1.2 g/kg α-LA組(P<0.05)(圖1-A)。各組之間的增重率無顯著差異(P>0.05)(圖1-B)。3‰低鹽對照組和0.3、0.6、1.2 g/kg α-LA組的肝體指數均顯著低于25‰海水對照組(P<0.05)(圖1-C)。1.2 g/kg α-LA組的肥滿度顯著低于3‰低鹽對照組和25‰海水對照組(P<0.05)(圖1-D)。

數據柱標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.2 低鹽脅迫下飼料中添加α-LA對凡納濱對蝦抗氧化能力的影響

由圖2可知，與25‰海水對照組相比，3‰低鹽對照組和0.3、0.6 g/kg α-LA組的肝胰腺MDA含量顯著增加(P<0.05)；1.2 g/kg α-LA組的肝胰腺MDA含量與25‰海水對照組無顯著差異(P>0.05)，但顯著低于3‰低鹽對照組(P<0.05)(圖2-A)。各組之間的肝胰腺CAT活性無顯著差異(P>0.05)(圖2-B)。與25‰海水對照組相比，3‰低鹽對照組和0.3 g/kg α-LA組的肝胰腺SOD活性極顯著降低(P<0.01)；與3‰低鹽對照組相比，0.6、1.2 g/kg α-LA組的肝胰腺SOD活性顯著升高(P<0.05)(圖2-C)。與25‰海水對照組相比，3‰低鹽對照組和0.3 g/kg α-LA組的肝胰腺LDH活性極顯著升高(P<0.01)；與3‰低鹽對照組相比，1.2 g/kg α-LA組的肝胰腺LDH活性顯著降低(P<0.05)(圖2-D)。

圖2 低鹽脅迫下飼料中添加α-LA對凡納濱對蝦抗氧化能力的影響Fig.2 Effects of dietary α-LA on antioxidant capacity of Litopenaeus vannamei under low salinity stress

2.3 低鹽脅迫下飼料中添加α-LA對凡納濱對蝦腸道組織學形態的影響

如圖3所示，25‰海水對照組、3‰低鹽對照組和1.2 g/kg α-LA組的腸道組織學形態存在明顯差異。與25‰海水對照組(圖3-A、圖3-B)相比，3‰低鹽對照組(圖3-C、圖3-D)的腸道黏膜上皮細胞與基底膜存在明顯剝離現象；與3‰低鹽對照組相比，1.2 g/kg α-LA組(圖3-E、圖3-F)的腸道壁較平滑。

2.4 低鹽脅迫下飼料中添加α-LA對凡納濱對蝦腸道菌群組成的影響

2.4.1 alpha多樣性分析

腸道微生物檢測共得到1 201 941條高質量序列，平均每個樣本有85 028條序列，序列平均長度為412 bp。相似度在97%以上的序列聚類為OTU。如圖4-A所示，在腸道菌群豐度指數結果中，25‰海水對照組與3‰低鹽對照組的腸道菌群Chao1、ACE指數無顯著差異(P>0.05)，但是均顯著或極顯著低于1.2 g/kg α-LA組(P<0.05或P<0.01)。在腸道菌群多樣性指數結果中，3‰低鹽對照組的腸道菌群Simpson、Shannon指數最低，25‰海水對照組最高，且3‰低鹽對照組與1.2 g/kg α-LA組差異顯著(P<0.05)；25‰海水對照組與3‰低鹽對照組差異極顯著(P<0.01)，與1.2 g/kg α-LA組差異顯著(P<0.05)。

A：25‰海水對照組(100×)；B：25‰海水對照組(400×)；C：3‰低鹽對照組(100×)；D：3‰低鹽對照組(400×)；E：1.2 g/kg α-LA組(100×)；F：1.2 g/kg α-LA組(400×)。

2.4.2 beta多樣性分析

基于Unweighted Unifrac來進行主坐標分析(PCoA)，并選取貢獻率最大的主坐標組合進行作圖，如圖4-B所示，25‰海水對照組(紅色正方形)與3‰低鹽對照組(藍色圓形)、1.2g/kg α-LA組(綠色三角形)用不同色塊區別開，在主成分1(PC1)方向上所代表的25‰海水對照組與其他2組疑似影響因素占41.15%，表明群落結構差異較大；在主成分2(PC2)方向上3‰低鹽對照組與1.2 g/kg α-LA組相聚較近，疑似影響因素僅占12.68%，群落結構差異不明顯。PCoA結果表明，低鹽處理因素對腸道菌群的影響要高于飼料中添加α-LA對腸道菌群的影響。

2.4.3 Venn圖分析

如圖4-C所示，由凡納濱對蝦腸道菌群Venn圖分析可知，25‰海水對照組、3‰低鹽對照組、1.2 g/kg α-LA組的OTU數目分別為307、317、399個，其中，3個試驗組共同含有196個相同的OTU，占25‰海水對照組、3‰低鹽對照組和1.2 g/kg α-LA組的比例分別為63.84%、61.83%、49.12%。25‰海水對照組、3‰低鹽對照組、1.2 g/kg α-LA組特有的OTU數目分別為60、16、89個，分別占總OTU數目的19.54%、0.05%、22.31%。

圖4 25‰海水對照組、3‰低鹽對照組和1.2 g/kg α-LA組凡納濱對蝦腸道菌群多樣性差異圖Fig.4 Diversity difference map of intestinal microflora of Litopenaeus vannamei in 25‰ seawater control group, 3‰ low salt control group and 1.2 g/kg α-LA group

2.4.4 腸道菌群群落組成分析

如圖5-A所示，25‰海水對照組腸道中占主導的優勢菌門為變形菌門(76.03%)和擬桿菌門(20.72%)；3‰低鹽對照組腸道中占主導的優勢菌門為擬桿菌門(68.17%)和變形菌門(25.91%)；1.2 g/kg α-LA組腸道中占主導的優勢菌門為擬桿菌門(61.24%)和變形菌門(29.77%)，上述優勢菌門總和均占到對應腸道總細菌門類的90%以上。如表2所示，與25‰海水對照組相比，3‰低鹽對照組的腸道中擬桿菌門相對豐度顯著升高(P<0.05)，變形菌門和梭桿菌門相對豐度顯著降低(P<0.05)。與3‰低鹽對照組相比，1.2 g/kg α-LA組的腸道中厚壁菌門、放線菌門相對豐度顯著升高(P<0.05)。

表2 25‰海水對照組、3‰低鹽對照組和1.2 g/kg α-LA組凡納濱對蝦腸道菌群門水平組成Table 2 Composition of intestinal microflora at phylum level of Litopenaeus vannamei among 25‰ seawater control group, 3‰ low salt control group and 1.2 g/kg α-LA group %

如圖5-B所示，25‰海水對照組腸道中占主導的優勢菌屬分別為魯杰氏菌屬、Celeribacter、Tenacibaculum和Roseivivax；3‰低鹽對照組腸道中占主導的優勢菌屬分別為Algoriphagus、副球菌屬、Rheinheimera；1.2 g/kg α-LA組腸道中對占主導的優勢菌屬分別為Algoriphagus、副球菌屬、黃桿菌屬和溶桿菌屬。如表3所示，1.2 g/kg α-LA組的腸道中黃桿菌屬、Actibacter、Tropicimonas、Shinella相對豐度顯著高于25‰海水對照組(P<0.05)，Algoriphagus相對豐度顯著低于3‰低鹽對照組(P<0.05)。3‰低鹽對照組的腸道中魯杰氏菌屬、Celeribacter、Tenacibaculum、Roseivivax、Sungkyunkwania、Roseovarius、Hoppeia、Shimia、假交替單胞菌屬、Tamlana相對豐度顯著低于25‰海水對照組(P<0.05)，Algoriphagus、副球菌屬、Rheinheimera、Defluviimonas相對豐度顯著高于25‰海水對照組(P<0.05)。1.2 g/kg α-LA組的腸道中黃桿菌屬、Shinella和Actibacter相對豐度顯著高于3‰低鹽對照組(P<0.05)。

表3 25‰海水對照組、3‰低鹽對照組和1.2 g/kg α-LA組凡納濱對蝦腸道菌群屬水平組成Table 3 Composition of intestinal microflora at genus level of Litopenaeus vannamei among 25‰ seawater control group, 3‰ low salt control group and 1.2 g/kg α-LA group %

如圖6所示，根據全部樣本在腸道菌群屬水平的豐度信息及物種注釋，篩選豐度在前35的菌屬，根據其在每個樣本中的豐度信息，從樣本和物種2個層面進行聚類，繪制成熱圖。與3‰低鹽對照組相比，1.2 g/kg α-LA組的腸道中希瓦氏菌屬、紅桿菌屬、墨氏菌屬相對豐度顯著降低(P<0.05)，而Donghicola、Haloferula、Xanthomarina、Marivita等菌屬相對豐度顯著增加(P<0.05)。

2.4.5 PICRUSt腸道菌群功能預測

通過PICRUSt預測，3‰低鹽對照組和1.2 g/kg α-LA組的腸道具有顯著差異的細菌的相關基因功能列于表4。具有顯著差異的腸道微生物富集的KEGG通路分為六大類：新陳代謝(metabolism)、細胞過程(cellular processes)、生物體系統(organismal systems)、人類疾病(human diseases)、環境信息處理(environmental information processing)以及未分類的(unclassified)。其中，腸道菌群編碼的大多數差異基因與新陳代謝有關。值得一提的是，與3‰低鹽對照組相比，1.2 g/kg α-LA組的腸道微生物編碼的基因中與加壓素調節的水重吸收(vasopressin-regulated water reabsorption)、胞吞作用(endocytosis)以及FcγR介導的吞噬作用(Fc gamma R-mediated phagocytosis)有關的KEGG途徑顯著富集(P<0.05)。

表4 低鹽脅迫下飼料中添加α-LA對凡納濱對蝦腸道菌群功能預測的相對豐度的影響Table 4 Effects of dietary α-LA on relative abundance of intestinal microflora function prediction of Litopenaeus vannamei under low salinity stress

3 討 論

3.1 低鹽脅迫下飼料中添加α-LA對凡納濱對蝦生長性能的影響

有研究表明，在3‰低鹽脅迫下飼養的凡納濱對蝦的增重率和存活率較正常鹽度下要低[24]。本研究中，3‰低鹽對照組對蝦的存活率降低驗證了以上觀點，而添加了α-LA組中的對蝦存活率較3‰低鹽對照組相比增加，與5‰海水對照組相比略低但不存在顯著差異。與5‰海水對照組相比，低鹽脅迫下的所有組別的肝體指數均顯著下降，這可能是低鹽脅迫造成的結果[1]。攝入含0.3、0.6 g/kg α-LA飼料的凡納濱對蝦生長性能表現良好，飼喂含1.2 g/kg α-LA飼料的凡納濱對蝦肥滿度與5‰海水對照組和3‰低鹽對照組相比均顯著降低，這可能是由于高添加量的α-LA導致，但其他生長指標并未受到顯著影響，這與此前有研究提出的1.2 g/kg α-LA會抑制草魚的食物攝入從而降低最終體重的結果相悖[25]。除卻試驗對象不同可能導致的作用劑量差異這一原因以外，低鹽脅迫下的養殖環境使得飼料中的α-LA發揮抗氧化作用從而出現不同的結果或許是另一原因。除此之外，有報道稱在甲殼類動物中華絨螯蟹的飼料中添加1.2或2.4 g/kg α-LA能夠使蟹獲得最佳的生長性能，且更高劑量的α-LA添加量則會抑制其生長[22]；在皺紋盤鮑的研究中也同樣得到了類似結論[23]。因此，本研究結果得出，飼料中添加1.2g/kgα-LA并未對凡納濱對蝦的攝食造成抑制，且能夠提高凡納濱對蝦在低鹽脅迫下的存活率和生長性能。試驗中的α-LA高添加量并未與低添加量形成顯著差異，因此1.2 g/kg的α-LA添加量可能仍未達到可提升生長表現的最大劑量，但具體的適宜添加量仍需要進一步的探討。

Protecobacteria：變形菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Actinobacteria：放線菌門；Acidobacteria：酸桿菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Chloroflexi：綠彎菌門；Planctomycetes：浮霉菌門；Fusobacteria：梭桿菌門；unidentified_Bacteria：未知菌門；Ruegeria：魯杰氏菌屬；Lysobacter：溶桿菌屬；Paracoccus：副球菌屬；Shewanella：希瓦氏菌屬；Flavobacterium：黃桿菌屬；Others：其他。

3.2 低鹽脅迫下飼料中添加α-LA對凡納濱對蝦抗氧化能力的影響

凡納濱對蝦在低鹽脅迫下會被誘導氧化產生過量的ROS，導致對蝦的細胞和組織被破壞[1,26-27]。由于對蝦生理結構簡單，因此抗氧化酶在清除過量ROS過程中起到至關重要的作用。α-LA作為一類天然的抗氧化劑，具有非常出色的抗氧化能力[10,28]。為了研究α-LA對凡納濱對蝦低鹽脅迫下的保護作用，本試驗篩選了SOD、CAT作為評價標準。SOD是一類機體天然存在的超氧自由基清除因子，并且是重要的內源性抗氧化劑，能夠將超氧自由基轉化為過氧化氫，而CAT則能夠將過氧化氫立即分解成完全無害的水，因此SOD和CAT活性增高在清除ROS中起重要作用，可抵抗低鹽脅迫帶來的氧化應激。Wang等[16]研究發現，α-LA的添加極大提高了肉雞的SOD活性；Xu等[21-22]的研究也充分證實了一定劑量的α-LA能夠提升中華絨螯蟹的SOD活性。而本研究結果與上述報道相似，飼喂0.6、1.2 g/kg α-LA的凡納濱對蝦肝胰腺SOD活性顯著高于3‰低鹽對照組。值得一提的是，本研究中α-LA的添加未能使凡納濱對蝦的肝胰腺CAT活性有顯著變化，但與3‰低鹽對照組相比有降低的趨勢，這與此前Zhang等[23]對幼鮑飼喂α-LA的研究結果一致。MDA含量是反映機體抗氧化能力的重要參數，可以反映機體脂質過氧化速率和強度，也能間接反映組織過氧化損傷程度。Bast等[29]研究發現，束縛應激下的大鼠在服用α-LA后，組織MDA含量顯著降低至正常水平；在中華絨螯蟹[21]中也得到相似的結果。本研究結果與上述報道類似，1.2 g/kg α-LA組的凡納濱對蝦肝胰腺MDA含量相比低鹽脅迫下的其他組別降低。此外，LDH作為廣泛存在于水生動物機體組織的一種重要同工酶，組織受損時其活性升高[30]。Hernández-Palomares等[31]報道了凡納濱對蝦在缺氧脅迫下肝胰腺LDH活性會顯著升高，但添加了α-LA后肝胰腺LDH活性沒有發生變化。本研究中，凡納濱對蝦肝胰腺LDH活性在低鹽脅迫下升高，可知肝胰腺組織在低鹽脅迫下會造成損傷，但在飼喂了α-LA后，肝胰腺LDH活性得到升高，因此，α-LA能夠緩解低鹽環境對凡納濱對蝦的負面效應。

Actinobacteria：放線菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Protecobacteria：變形菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；unidentified_Bacteria：未知細菌門；Ruegeria：魯杰氏菌屬；unidentified_Rhodobacteraceae：未鑒定的紅桿菌屬；unidentified_Bacteria：未知細菌；Rhodobacter：紅桿菌屬；Erythrobacter：赤細菌屬；Flavobacterium：黃桿菌屬；Paracoccus：副球菌屬；Microbacterium：微桿菌屬；Cytophaga：噬細胞菌屬。

以上結果表明，飼料中添加α-LA能夠提高凡納濱對蝦抗氧化酶的活性和抗氧化能力，從而減輕其在低鹽脅迫下的氧化壓力。但α-LA調節凡納濱對蝦應對低鹽脅迫的具體的作用機制尚未完全清楚，仍需進一步的深入研究。

3.3 低鹽脅迫下飼料中添加α-LA對凡納濱對蝦腸道組織學形態和菌群結構的影響

腸道是凡納濱對蝦行使消化和營養物質吸收的主要器官，完整的腸道組織結構對機體保持良好的消化性能至關重要。環境因素能夠直接影響對蝦的腸道組織學，一旦腸道結構被破壞，可能會增加病原體入侵宿主的風險。本研究證實，低鹽脅迫會導致凡納濱對蝦腸道皺襞細胞受損，腸上皮細胞變短，肌肉層變薄。1.2 g/kg α-LA組的凡納濱對蝦腸道對比3‰低鹽對照組，并沒有出現組織空泡現象，但其他特征并無明顯差異。因此，凡納濱對蝦在攝入含有α-LA的飼料后，能夠對低鹽脅迫下對蝦造成的腸道組織損傷起到一定的修復作用。

腸道微生物的菌群結構組成與宿主的免疫反應、營養吸收密切相關，能夠參與宿主各項生命機能的調節[32]。凡納濱對蝦腸道菌群的構成受環境、生長階段以及飼料等多重因素的影響，健康平衡的腸道菌群有益于對蝦的健康生長[33]。王元等[34]的研究表明，凡納濱對蝦在海水和淡水2種養殖模式中呈現的腸道菌群存在較大差異。而在本研究中，與25‰海水對照組相比，3‰低鹽對照組的菌群豐度并無顯著差異，但菌群多樣性降低。Jones等[35]研究表明，腸道菌群多樣性降低可能會破壞菌群結構穩態，增加機體致病風險；這是低鹽養殖下對蝦產量受到制約的因素之一。值得一提的是，飼喂添加了1.2 g/kg α-LA飼料的凡納濱對蝦的腸道菌群豐度和多樣性均較3‰低鹽對照組有所提升，使得腸道微生態環境保持相對平衡，一定程度上緩解了低鹽脅迫導致的腸道菌群氧化應激。在張蓉等[36]關于小鼠的研究中，也發現α-LA具有調整腸道氧化還原狀態的功效。

根據先前的報道，變形菌門是海水蝦的優勢腸道菌群[37-38]。然而在本研究中發現，低鹽脅迫使得25‰海水對照組和3‰低鹽對照組間的腸道菌群群落結構差異巨大，25‰海水對照組占主導地位的變形菌門在低鹽脅迫后被擬桿菌門所取代，腸道菌群結構的失衡使得條件致病菌，如黃桿菌屬和希瓦氏菌屬等相對豐度上升，極易導致凡納濱對蝦受到病害侵襲。值得一提的是，在飼喂1.2 g/kg α-LA之后，凡納濱對蝦腸道中的希瓦氏菌屬相對豐度相比3‰低鹽對照組顯著下降，黃桿菌屬相對豐度顯著升高。黃桿菌屬是潛在的致病菌，常常造成養殖魚類的死亡[39]，目前尚未清楚α-LA與黃桿菌屬之間的聯系，還需要進一步的研究。此外，研究表明，Donghicola有很大潛力被用作益生菌[40]；Marivita同樣被證明能夠有效降低條件致病菌弧菌的相對豐度和種類[41]。并且根據這項研究產生的屬水平熱圖發現，1.2 g/kg α-LA組中這2種菌株顯著聚集。本研究從腸道菌群的角度探討了α-LA對凡納濱對蝦的影響，但α-LA影響腸道菌群的機制尚未明晰，仍需要進一步的探究。

3.4 低鹽脅迫下飼料中添加α-LA對凡納濱對蝦腸道菌群功能預測的影響

PICRUSt分析顯示，在胞吞作用調節途徑中，3‰低鹽對照組與1.2 g/kg α-LA組之間存在顯著差異，由于低鹽脅迫下的對蝦更容易感染病害，并且胞吞作用還能夠通過受體介導的內吞過程將細菌吸收到細胞中，然后在脂質體中將其破壞以充當針對細菌的防御機制，因此胞吞作用對甲殼類動物的抗病毒免疫非常重要[42]。據此，本研究推測，α-LA能夠通過控制微生物介導的功能從而參與胞吞作用的調節。此外，1.2 g/kg α-LA組中加壓素調節的水重吸收的功能途徑顯著增加，因此，本研究推測α-LA也能夠對機體的滲透壓進行調節從而使對蝦適應3‰鹽度的低鹽脅迫。此外，Fcγ受體參與多個免疫系統作用，例如吞噬細胞的吞噬作用、炎癥介質釋放和抗體依賴性細胞的細胞毒性等[43]。吞噬作用主要是由Fcγ受體在白細胞與吞噬顆粒接觸的位點聚集而觸發，它是先天免疫反應的重要組成部分，通過對感染性病原體的吞噬和破壞，在宿主防御機制中發揮著關鍵作用[44]。本研究中，1.2 g/kg α-LA組別與3‰低鹽對照組相比，FcγR介導的吞噬作用的預測通路顯著富集，因此，本研究推測，α-LA能夠通過刺激對蝦腸道菌群的Fcγ受體功能聚集從而增強其在低鹽脅迫下的免疫能力。

4 結 論

在3‰鹽度的低鹽脅迫下，凡納濱對蝦腸道組織受損，腸道菌群組成改變。飼料中添加0.6 g/kg α-LA可以提高低鹽脅迫下凡納濱對蝦的存活率和抗氧化能力，對腸道損傷具有一定的修復作用，并能夠提高腸道菌群組成多樣性和功能。因此，α-LA能夠作為凡納濱對蝦低鹽養殖環境下的有效飼料添加劑，緩解低鹽養殖的負效應。