瘤胃細(xì)菌脲酶抑制劑瑞香素的篩選與效果評(píng)價(jià)

賀 越 趙圣國(guó) 張曉音 鄭 楠 王加啟*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(北京)，北京 100193)

反芻動(dòng)物瘤胃微生物能利用尿素分解產(chǎn)生的氨合成機(jī)體可利用的微生物蛋白，所以尿素可作為一種經(jīng)濟(jì)的蛋白質(zhì)飼料替代品[1-2]。瘤胃尿素的分解依賴于瘤胃細(xì)菌脲酶，脲酶催化尿素水解的速度是尿素自然分解速度的1014倍[3]，尿素飼喂不當(dāng)容易造成動(dòng)物氨中毒[4]，這嚴(yán)重制約了尿素在動(dòng)物生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用。脲酶抑制劑是脲酶活性調(diào)控研究的前沿。

細(xì)菌脲酶是一種鎳金屬酶[5]，通常由結(jié)構(gòu)蛋白(UreA、UreB、UreC)和輔助蛋白(UreD/H、UreF、UreG、UreE)組成[6]。不同微生物來源的脲酶的結(jié)構(gòu)蛋白具有差異，如產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶由UreA、UreB、UreC 3個(gè)亞基聚合形成(UreABC)3[7]，耶爾森氏菌脲酶為[(UreABC)3]4[8]，幽門螺桿菌脲酶為[(UreAB)3]4[9]。細(xì)菌脲酶的活性中心位于序列高度保守的UreC亞基[10]，每1個(gè)活性中心包含2個(gè)鎳離子，2個(gè)鎳離子由1個(gè)羧化的賴氨酸連接[11]，活性中心底物的進(jìn)入和產(chǎn)物的排出由1個(gè)柔性的flap區(qū)域調(diào)控[12]。脲酶活性中心及flap區(qū)域是活性研究的重要靶點(diǎn)。

目前已經(jīng)報(bào)道了多種脲酶抑制劑，其中多為化學(xué)合成的化合物。乙酰氧肟酸是目前唯一被批準(zhǔn)商用的脲酶抑制劑[13]，但是在瘤胃中穩(wěn)定性差、對(duì)動(dòng)物的健康有影響[14]，所以開發(fā)安全、高效的脲酶抑制劑是目前研究的重點(diǎn)。自然界蘊(yùn)含豐富的天然產(chǎn)物資源，其中包括大量具有生物活性、化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣的植物來源的天然化合物，這些化合物在疾病治療、糧食資源等方面應(yīng)用廣泛[15]。在這種背景下，研究植物來源的天然產(chǎn)物作為脲酶抑制劑調(diào)控脲酶活性在動(dòng)物生產(chǎn)中具有重要價(jià)值。本研究擬運(yùn)用分子對(duì)接的方法對(duì)植物源化合物庫進(jìn)行篩選，并進(jìn)一步結(jié)合瘤胃細(xì)菌脲酶活性試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期獲得對(duì)瘤胃脲酶具有抑制效果的天然化合物，為天然化合物抑制瘤胃細(xì)菌脲酶的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試劑材料

試驗(yàn)用瘤胃液來自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院昌平基地荷斯坦奶牛[泌乳中期，體重(550±23) kg]；試驗(yàn)用植物源化合物庫信息及植物源天然化合物來源于上海陶素生化科技有限公司，純度>98%；刀豆脲酶、尿素、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)粉末、四水合酒石酸鉀鈉、還原性谷胱甘肽(GSH)、L-半胱氨酸(L-Cys)、硼酸(BA)購于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，分析純；偏磷酸購于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；納氏試劑購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，分析純；二甲基亞砜(DMSO)購于北京索萊寶科技有限公司；尿素氮含量測(cè)試試劑盒購于南京建成生物工程研究所；試驗(yàn)用氣體購于北京市北溫氣體制造廠；試驗(yàn)均使用超純水。

試驗(yàn)用到的儀器和軟件包括Auto Dock vina軟件、Discovery Studio 4.5 Client軟件、超純水儀(F6BA99920)、pH計(jì)(SG2)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(sigma 3-18k)、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(UP-250)、生化振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-F100)、磁力攪拌器(IKA big squid)、酶標(biāo)儀(Thermo Electron Varioskan Flash)、厭氧培養(yǎng)箱(PLAS-LAB 855-AC & 855-ACB)。

1.2 溶液配制

50 mmol/L HEPES緩沖液：稱取11.9 g HEPES粉末，適量去離子水溶解后，調(diào)節(jié)pH至7.5，定容至1 L。

50 mmol/L尿素緩沖液：稱取0.3 g尿素，用HEPES緩沖液溶解，定容至100 mL。

瑞香素溶液：10 mg瑞香素中加入561.4 μL DMSO，即配制成濃度為100 mmol/L的瑞香素母液，后續(xù)使用根據(jù)所需濃度進(jìn)行稀釋。

DMSO溶液：DMSO溶液中DMSO的含量與對(duì)應(yīng)試驗(yàn)組化合物中DMSO含量一致。

硫醇試劑溶液：稱取L-Cys 1.21 g，HEPES緩沖液定容至100 mL，稱取GSH 3.07 g，HEPES緩沖液定容至100 mL，2種硫醇試劑母液濃度均為100 mmol/L，后續(xù)使用根據(jù)所需進(jìn)行稀釋。

BA溶液：稱取BA 0.62 g，HEPES緩沖液定容至100 mL，BA溶液母液濃度為100 mmol/L，后續(xù)使用根據(jù)所需進(jìn)行稀釋。

2 試驗(yàn)方法

2.1 天然化合物的篩選

本試驗(yàn)使用的瘤胃細(xì)菌脲酶結(jié)構(gòu)參考實(shí)驗(yàn)室之前的同源建模[16]。利用Auto Dock vina軟件對(duì)瘤胃細(xì)菌脲酶進(jìn)行去除水分子、加氫及計(jì)算電荷等處理，對(duì)植物源化合物庫中的化合物進(jìn)行同樣處理，而后選擇細(xì)菌脲酶UreC亞基的第308位氨基酸殘基至第336位氨基酸殘基的區(qū)域和活性中心區(qū)域進(jìn)行對(duì)接，選擇最佳結(jié)合模型。進(jìn)一步測(cè)定對(duì)接結(jié)果較好的4種天然化合物對(duì)瘤胃細(xì)菌脲酶的抑制效果。

2.2 4種天然化合物對(duì)瘤胃細(xì)菌脲酶活性的影響

2.2.1 瘤胃細(xì)菌脲酶的提取

挑選3頭荷斯坦瘺管奶牛，采集瘤胃內(nèi)容物100 mL，通過4層無菌紗布過濾，將濾液(瘤胃液)分裝到50 mL無菌離心管中，并置于液氮中保存。

瘤胃液用流水解凍后，300×g離心5 min，收集上清液到新的離心管中，12 000×g離心10 min，棄上清，用25 mL HEPES緩沖液重懸沉淀，12 000×g離心10 min，棄上清，用25 mL HEPES緩沖液重懸沉淀，將其置于冰上，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行破碎(150 W，超聲5 s，停5 s，超聲10 min)，12 000×g離心10 min，收集上清，即瘤胃細(xì)菌脲酶。離心過程均為4 ℃。

2.2.2 4種天然化合物對(duì)瘤胃細(xì)菌脲酶的抑制效果的測(cè)定

本試驗(yàn)測(cè)定脲酶活性采用納氏試劑法。試驗(yàn)組中，取40 μL瘤胃細(xì)菌脲酶于96孔板中，加入40 μL化合物溶液(終濃度10 μmol/L)和100 μL尿素緩沖液(終濃度28 mmol/L)；試驗(yàn)陰性對(duì)照組中，取40 μL瘤胃細(xì)菌脲酶于96孔板中，加入40 μL化合物溶液(終濃度10 μmol/L)和100 μL HEPES緩沖液；脲酶組中，取40 μL瘤胃細(xì)菌脲酶于96孔板中，加入40 μL DMSO溶液和100 μL尿素緩沖液；脲酶陰性對(duì)照組中，取40 μL瘤胃細(xì)菌脲酶于96孔板中，加入40 μL DMSO溶液和100 μL HEPES緩沖液。以上每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，樣品加好后，置于生化振蕩培養(yǎng)箱中，37 ℃孵育30 min，加入10 μL酒石酸鉀鈉溶液，混合均勻，加入10 μL納氏試劑溶液，混合均勻后，室溫放置10 min。而后置于酶標(biāo)儀中，設(shè)置420 nm波長(zhǎng)，測(cè)定吸光度(OD)值。剩余活性計(jì)算公式如下：

剩余活性(%)=[(試驗(yàn)組OD值-試驗(yàn)陰性
對(duì)照組OD值)/(脲酶組OD值-脲酶
陰性對(duì)照組OD值)]×100。

根據(jù)4種天然化合物對(duì)瘤胃細(xì)菌脲酶的抑制結(jié)果，對(duì)其中抑制效果最好的化合物瑞香素作進(jìn)一步的評(píng)價(jià)。

2.3 瑞香素對(duì)瘤胃細(xì)菌脲酶和刀豆脲酶的半抑制濃度(IC50)值的測(cè)定

測(cè)定瑞香素對(duì)瘤胃細(xì)菌脲酶的IC50值采用納氏試劑法，并且以刀豆脲酶作為對(duì)照，瑞香素對(duì)瘤胃細(xì)菌脲酶IC50值測(cè)定濃度設(shè)置為0、10、20、80、100、160、200 μmol/L，瑞香素對(duì)刀豆脲酶IC50值測(cè)定濃度設(shè)置為0、2、10、20、30、40、45 μmol/L，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，測(cè)定體系及相應(yīng)對(duì)照設(shè)置、剩余活性計(jì)算同2.2.2。通過GraphPad Prism 6 進(jìn)行曲線擬合，得到IC50值。

2.4 瑞香素對(duì)瘤胃細(xì)菌脲酶的抑制類型

瑞香素對(duì)瘤胃脲酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定采用納氏試劑法，瑞香素設(shè)0、80、160、200 μmol/L 4個(gè)終濃度，尿素設(shè)0、0.875、1.750、3.500、7.000、14.000 mmol/L 6個(gè)終濃度，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，其中尿素0 mmol/L為試驗(yàn)陰性對(duì)照組，測(cè)定體系同2.2.2。根據(jù)測(cè)得的OD值計(jì)算出相應(yīng)處理下的反應(yīng)速率(V)，在GraphPad Prism 6中進(jìn)行反應(yīng)速率的倒數(shù)關(guān)于尿素濃度(S)的倒數(shù)的線性擬合，進(jìn)一步根據(jù)米氏方程計(jì)算得到酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)——米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速率(Vmax)，方程如下：

2.5 硫醇試劑、脲酶Ni2+競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑對(duì)瑞香素抑制瘤胃細(xì)菌脲酶的影響

本試驗(yàn)選擇L-Cys、GSH 2種硫醇試劑和BA這種脲酶Ni2+競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。脲酶活性測(cè)定選擇納氏試劑法，每個(gè)處理中添加40 μL瘤胃細(xì)菌脲酶和100 μL尿素緩沖液，其中對(duì)照組中添加40 μL DMSO溶液，瑞香素組中添加40 μL瑞香素溶液，L-Cys、GSH、BA組中添加相應(yīng)的溶液40 μL，L-Cys/GSH/BA+瑞香素組中各添加20 μL，瑞香素終濃度為200 μmol/L，L-Cys、GSH、BA終濃度都為0.25 mmol/L，用HEPES緩沖液代替尿素緩沖液作為相對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照組，計(jì)算方法同2.2.2。利用GraphPad Prism 6進(jìn)行作圖分析。

2.6 瑞香素與瘤胃脲酶的結(jié)合位點(diǎn)分析

利用Discovery Studio 4.5 Client軟件對(duì)瑞香素與瘤胃脲酶活性中心對(duì)接的結(jié)果進(jìn)行作圖，分析瑞香素與瘤胃脲酶相互結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)及作用力。

2.7 瑞香素對(duì)瘤胃微生物尿素氮利用的影響

瘤胃液的采集同2.2.1，經(jīng)過紗布過濾后，用20 mL無菌注射器注射入進(jìn)過厭氧及滅菌后的血清瓶中，冰上保存。

厭氧稀釋液及厭氧培養(yǎng)基配制參考實(shí)驗(yàn)室之前的配方[17]。瑞香素溶液和尿素溶液用厭氧稀釋液配制，濃度分別為3.8 mmol/L和0.4 mol/L。在厭氧培養(yǎng)箱中將20 mL新鮮瘤胃液與40 mL厭氧培養(yǎng)基混合均勻后分裝到螺口培養(yǎng)管中，每管9 mL，試驗(yàn)組中加入500 μL瑞香素溶液，對(duì)照組中則加入500 μL DMSO溶液(DMSO含量與瑞香素溶液一致，用厭氧稀釋液配制)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，室溫下反應(yīng)30 min后，加入500 μL尿素溶液，置于厭氧培養(yǎng)箱中39 ℃培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、12 h采集200 μL培養(yǎng)液，采集的樣品12 000×g，4 ℃離心5 min，收集上清，加入400 μL 25%偏磷酸，于-20 ℃保存。尿素氮含量利用尿素氮測(cè)試盒(二乙酰肟比色法)進(jìn)行測(cè)定。

2.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。在統(tǒng)計(jì)分析前，先利用軟件中分析-探索-Shapiro-Wilk檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布的2組數(shù)據(jù)間的比較采用分析-比較均值-獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行差異性比較；服從正態(tài)分布的多組數(shù)據(jù)間的比較采用分析-比較均值-單因素ANOVA，方差齊時(shí)用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。P<0.05表示結(jié)果差異顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 分子對(duì)接篩選天然化合物庫

通過分子對(duì)接對(duì)植物來源化合物庫進(jìn)行多輪篩選，最后得到4種天然化合物作為瘤胃脲酶候選抑制劑，表1列出了這4種化合物分子對(duì)接得分以及化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

表1 4種天然化合物分子對(duì)接得分及化學(xué)結(jié)構(gòu)式信息Table 1 Molecular docking score and chemical formula information of four natural compounds

3.2 4種天然化合物對(duì)瘤胃細(xì)菌脲酶活性的影響

測(cè)定分子對(duì)接篩選出的4種天然化合物對(duì)瘤胃脲酶的抑制效果，結(jié)果如圖1所示，在濃度一致的情況下，瑞香素對(duì)瘤胃脲酶的抑制效果最好。

圖1 4種天然化合物作用后瘤胃細(xì)菌脲酶的剩余活性Fig.1 Residual activity of ruminal microbial urease interacted by four natural compounds

3.3 瑞香素對(duì)瘤胃細(xì)菌脲酶、刀豆脲酶活性的抑制效果分析

為了表征瑞香素對(duì)脲酶的抑制效果，通過測(cè)定不同濃度的瑞香素對(duì)瘤胃脲酶和刀豆脲酶的抑制率，并計(jì)算瑞香素對(duì)2種脲酶的IC50值。結(jié)果如圖2所示，瑞香素對(duì)瘤胃脲酶的IC50值為(93.43±3.87) μmol/L(圖2-A)，瑞香素對(duì)刀豆脲酶的IC50值為(16.47±0.79) μmol/L(圖2-B)。

圖2 不同瑞香素濃度作用后瘤胃細(xì)菌脲酶(A)、刀豆脲酶(B)剩余活性Fig.2 Residual activity of ruminal microbial urease (A) and jack been urease (B) with different concentrations of daphnetin

3.4 瑞香素抑制瘤胃細(xì)菌脲酶的酶動(dòng)力學(xué)分析

表2 不同瑞香素濃度對(duì)瘤胃細(xì)菌脲酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響Table 2 Effects of kinetic parameters of rumen bacterial urease by different concentrations of daphnetin

圖3 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法測(cè)定瑞香素對(duì)瘤胃細(xì)菌脲酶的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Fig.3 Kinetic parameters of rumen bacterial urease tested through Lineweaver-Burk plots of different concentrations of daphnetin

3.5 瑞香素抑制瘤胃細(xì)菌脲酶的作用位點(diǎn)分析

2種硫醇試劑L-Cys、GSH以及Ni2+競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑BA對(duì)瘤胃脲酶均具有一定的抑制效果，但是抑制效果均顯著低于瑞香素(圖4)。當(dāng)瑞香素與L-Cys或GSH聯(lián)合作用時(shí)，瑞香素對(duì)瘤胃脲酶的抑制效果顯著降低(P<0.05)(圖4-A和圖4-B)，當(dāng)瑞香素與BA聯(lián)合作用時(shí)，瑞香素對(duì)瘤胃脲酶的抑制效果變化不顯著(P>0.05)(圖4-C)。這一結(jié)果說明，瑞香素對(duì)瘤胃脲酶的抑制可能是通過與活性中心周圍的巰基相互作用。

3.6 瑞香素與瘤胃脲酶的結(jié)合位點(diǎn)分析

通過Discovery Studio 4.5 Client軟件分析得到瑞香素與瘤胃脲酶的最佳結(jié)合模式(圖5)。結(jié)果顯示，瑞香素上的2個(gè)羥基分別與氨基酸殘基Ala-166和His-245形成氫鍵，其中1個(gè)羥基還與氨基酸殘基Lys-216產(chǎn)生離子相互作用(鹽橋)，瑞香素的苯環(huán)結(jié)構(gòu)與氨基酸殘基Ala-362形成疏水結(jié)合Pi-Alkyl作用，瑞香素的雜環(huán)結(jié)構(gòu)能與氨基酸殘基Ala-362和Cys-318形成疏水結(jié)合Pi-Alkyl作用，并且還能與Ala-362形成碳?xì)滏I。

3.7 瑞香素對(duì)瘤胃微生物尿素利用的影響

由圖6結(jié)果可知，在瘤胃微生物體外厭氧培養(yǎng)試驗(yàn)中，添加瑞香素與只添加等量DMSO的對(duì)照組相比，0 h時(shí)，2組培養(yǎng)體系中尿素含量差異不顯著(P>0.05)，而在2、4、6 h時(shí)，瑞香素體系中尿素含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。這一結(jié)果說明，添加瑞香素在一定時(shí)間內(nèi)能有效地降低瘤胃微生物對(duì)尿素的分解。

標(biāo)注相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

A圖中深藍(lán)色球體為瘤胃細(xì)菌優(yōu)勢(shì)脲酶活性中心鎳離子，玫紅色結(jié)構(gòu)為瑞香素。B圖中圓形球體表示脲酶氨基酸殘基；實(shí)線表示瑞香素；虛線表示瑞香素與氨基酸之間的相互作用，其中深綠色表示氫鍵，淺綠色表示碳?xì)滏I，橙色表示離子相互作用，玫紅色表示Pi-Alkyl作用。

標(biāo)注*表示差異顯著(P<0.05)，未標(biāo)注*表示差異不顯著(P>0.05)。

4 討 論

分子對(duì)接是目前藥物篩選常用的方法[18]，這一方法在對(duì)脲酶有抑制效果的天然化合物研究中也有諸多應(yīng)用。如Kataria等[19]利用刀豆脲酶作為目標(biāo)蛋白，通過分子對(duì)接技術(shù)從多種天然酚類化合物中篩選出了桑色素、白藜蘆醇等化合物。有研究發(fā)現(xiàn)，桑色素及其類似物對(duì)幽門螺桿菌脲酶具有較好的抑制效果[20]，白藜蘆醇能通過抑制幽門螺桿菌脲酶而影響幽門螺桿菌在胃腸環(huán)境的生存和定植[21]，也有研究表明，白藜蘆醇的衍生物對(duì)刀豆脲酶具有抑制作用[22]。這些研究提示在眾多天然化合物種中篩選有效的脲酶抑制劑，分子對(duì)接技術(shù)是一種有效的方法。雖然脲酶的活性中心具有高度保守的特點(diǎn)，但是同一種化合物對(duì)不同微生物脲酶的抑制效果具有一定的差異。Li等[23]研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿對(duì)幽門螺桿菌脲酶的IC50值為2.40 mg/mL，而對(duì)刀豆脲酶的IC50值大于3.06 mg/mL，這提示我們靶向性的篩選脲酶抑制劑很有必要。本試驗(yàn)利用瘤胃優(yōu)勢(shì)脲酶基因簇的結(jié)構(gòu)基因[24]進(jìn)行同源建模，將得到的蛋白結(jié)構(gòu)通過分子對(duì)接對(duì)植物來源化合物庫進(jìn)行篩選，并測(cè)定了天然化合物對(duì)瘤胃細(xì)菌脲酶的抑制效果，最終確定瑞香素對(duì)瘤胃細(xì)菌脲酶抑制效果最好。

香豆素及其衍生物是分布廣泛的天然化合物，具有多種生物活性，一直以來備受化學(xué)家和藥物化學(xué)家的青睞。研究發(fā)現(xiàn)，這些天然化合物中有多種具有脲酶抑制效果[25]。瑞香素是一種天然香豆素衍生物，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等特性[26-27]。幽門螺桿菌產(chǎn)生的脲酶有利于幽門螺桿菌在人體胃腸環(huán)境中的生存，從而引發(fā)多種疾病，瑞香素能有效降低幽門螺桿菌活性[28]，并且也有研究發(fā)現(xiàn)瑞香素能抑制幽門螺桿菌脲酶活性[29]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，瑞香素對(duì)瘤胃細(xì)菌脲酶以及刀豆脲酶均具有抑制效果，并且對(duì)刀豆脲酶的抑制效果更好，猜測(cè)可能和本試驗(yàn)所用瘤胃細(xì)菌脲酶不純有關(guān)。這一現(xiàn)象也出現(xiàn)在天然化合物黃連堿的研究中，Li等[30]研究顯示，黃連堿對(duì)刀豆脲酶的IC50值低于對(duì)幽門螺桿菌脲酶。在后續(xù)天然化合物研究中可以考慮對(duì)瘤胃細(xì)菌脲酶進(jìn)行提純后分析。

隨著脲酶結(jié)構(gòu)以及抑制劑-脲酶結(jié)構(gòu)的解析，脲酶抑制劑對(duì)脲酶產(chǎn)生抑制作用的結(jié)構(gòu)機(jī)制有：一方面是脲酶抑制劑進(jìn)入脲酶活性口袋，與活性中心的鎳離子發(fā)生相互作用，阻礙底物與鎳離子的結(jié)合[31]；另一方面則是脲酶抑制劑與flap區(qū)域發(fā)生相互作用，限制這個(gè)皮瓣結(jié)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生抑制作用[32]。有研究表明，含硫醇化合物是一種脲酶活化劑，它能與脲酶氨基酸中的巰基發(fā)生相互作用[33]，脲酶flap區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸是1個(gè)半胱氨酸，當(dāng)硫醇化合物和脲酶抑制劑同時(shí)存在時(shí)，硫醇可通過與半胱氨酸的巰基結(jié)合而阻礙脲酶抑制劑與半胱氨酸的相互作用，從而降低脲酶抑制劑對(duì)脲酶的抑制效果[34]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，存在硫醇試劑時(shí)，瑞香素的抑制效果降低，說明瑞香素可能是通過與瘤胃細(xì)菌脲酶flap區(qū)域的半胱氨酸發(fā)生相互作用而產(chǎn)生抑制效果，同時(shí)分子對(duì)接結(jié)果也顯示瑞香素能與半胱氨酸形成比較強(qiáng)的相互作用。氨基酸殘基Lys-216是連接活性中心2個(gè)鎳離子的關(guān)鍵氨基酸，氨基酸殘基His245與其中的1個(gè)鎳離子發(fā)生配位[16]。本試驗(yàn)分子對(duì)接結(jié)果顯示了瑞香素結(jié)構(gòu)中的1個(gè)羥基能與這2個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基發(fā)生相互作用，而BA作用下瑞香素對(duì)瘤胃脲酶的抑制效果沒有明顯降低，猜測(cè)可能受到瘤胃脲酶純度較低的影響。很多屬于天然化合物的脲酶抑制劑也能通過與脲酶flap區(qū)域的半胱氨酸以及與活性中心的關(guān)鍵氨基酸殘基發(fā)生相互作用而對(duì)脲酶產(chǎn)生抑制效果，如槲皮素[35]、蘆薈樹脂和枸杞中的天然脲酶抑制劑成分[36]、兩面針中對(duì)脲酶具有抑制效果的天然化合物[37]等。

有研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃微生物產(chǎn)生的脲酶水解尿素是一個(gè)很快的過程，細(xì)菌脲酶能在30 min到2 h內(nèi)快速水解來自飼糧或者血液循環(huán)而來的尿素[38]，本研究對(duì)瘤胃微生物體外厭氧培養(yǎng)的結(jié)果顯示，培養(yǎng)體系中尿素含量在2 h顯著降低。一些脲酶抑制劑如乙酰氧肟酸、正丁基硫代磷酸三胺、鉍鹽類化合物[39]等能降低尿素的分解，但是這些化合物也存在諸多問題，如乙酰氧肟酸在瘤胃內(nèi)易降解，瘤胃微生物對(duì)正丁基硫代磷酸三胺能產(chǎn)生適應(yīng)性，還有些化合物對(duì)人和動(dòng)物機(jī)體有損害。本試驗(yàn)得到的天然化合物瑞香素在降低尿素分解方面具有很大的潛力，但是瑞香素在瘤胃內(nèi)的穩(wěn)定性、微生物對(duì)瑞香素是否具有適應(yīng)性等還需要進(jìn)一步的研究。

5 結(jié) 論

① 植物源化合物庫中對(duì)瘤胃細(xì)菌脲酶抑制效果最好的化合物是瑞香素，該化合物對(duì)瘤胃細(xì)菌脲酶的IC50值為93.43 μmol/L，是瘤胃細(xì)菌脲酶的混合型抑制劑。

② 瑞香素能通過與瘤胃細(xì)菌脲酶活性中心的多個(gè)氨基酸殘基以及flap區(qū)域的半胱氨酸相互作用而阻礙脲酶對(duì)尿素的分解。

③ 瑞香素能降低瘤胃微生物體外厭氧培養(yǎng)過程中尿素的分解。