響應面法優化綠蘿花多酚超臨界CO2萃取工藝

董新艷，高文懿，阮璽如，吳志革，趙世淳

(浙大寧波理工學院 生物與化學工程學院，浙江 寧波 315100)

綠蘿花是瑞香科、結香屬的植物滇結香的花蕾[1]。據文獻報道，目前綠蘿花中已經檢出多酚、多糖、脂肪酸等多種化合物[2-7]。現代藥理學研究結果證實綠蘿花作為一種名貴藏藥材具有治療糖尿病、冠心病、高血壓等功效[8-9]，這可能由于其富含多酚化合物[2，10]。目前，有關綠蘿花的研究報道僅限于揮發油、還原糖的提取分離及其抗氧化、降血糖等藥理作用及機制研究[11-12]，尚未有綠蘿花中多酚的超臨界提取工藝的相關報道。本文在單因素實驗的基礎上，采用響應面設計對綠蘿花中多酚的超臨界提取工藝進行優化，旨在為綠蘿花作為功能性食品及藥物的進一步開發提供理論科學依據。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

綠蘿花，購自青海優草商貿有限公司；沒食子酸標準品(純度≥89.9%)，中國食品藥品檢定研究院；Folin Ciocalteu試劑(2N)，上海荔達生物科技有限公司；無水乙醇、無水Na2CO3均為分析純，；高純CO2(純度≥99%)。

Spe-ed SFE-Z 2402AC型超臨界流體萃取儀；752PC紫外可見分光光度計；FA2004電子天平。

1.2 實驗方法

將干燥后的綠蘿花蕾粉粹成粉末，過4號篩(65目)。稱取綠蘿花粉末0.7 g，裝入不銹鋼萃取柱中，將萃取柱接入超臨界流體萃取儀的氣體管路，調節溫度為50 ℃和壓力為30 MPa，使得萃取流體處于超臨界狀態，調節夾帶劑的流速0.4 mL/min，動態萃取2 h。

1.3 分析方法

1.3.1 標準曲線的繪制 配制濃度為0.146 mg/mL的沒食子酸標準溶液，分別移取2.5，3，4.5，7，8.5，10 mL沒食子酸標準溶液于10 mL棕色容量瓶中，用去離子水定容。分別移取不同濃度沒食子酸溶液1 mL于25 mL棕色容量瓶中，分別加入2 mL福林酚原液，靜止 8 min 后，再各加入 6 mL 7.5% Na2CO3溶液，用去離子水定容至25 mL，搖勻后靜置于25 ℃恒溫槽中進行顯色反應2 h，于波長760 nm下測量其吸光度。以吸光度值和沒食子酸濃度為橫縱坐標，繪制標準曲線為：Y=5.789 96X-0.057 32(R=0.999 58)。

1.3.2 綠蘿花中多酚得率的測定 超臨界萃取結束后，將接收瓶中的提取液進行旋蒸，并用80%乙醇定容于25 mL容量瓶中，從中移取3～10 mL于棕色容量瓶中，用去離子水定容。取1 mL稀釋后的樣品溶液至25 mL的棕色容量瓶中，按1.3.1節采用Folin-Ciocalteu[13]比色法測定多酚含量，并根據標準曲線計算多酚得率。

式中C——通過標準曲線計算得出的多酚濃度，mg/mL；

m——稱取的花的質量，g。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇夾帶劑的濃度對多酚得率的影響 以乙醇水溶液為夾帶劑，提取壓力為30 MPa，萃取溫度為50 ℃，萃取時間為2 h，夾帶劑流速為0.4 mL/min，考察夾帶劑(乙醇水溶液)中乙醇的體積分率對綠蘿花中多酚萃取得率的影響，結果見圖1。

由圖1可知，夾帶劑(乙醇水溶液)中乙醇的體積分率升高，多酚得率先增加再減小，在乙醇濃度為70%時，多酚得率出現峰值。這主要是由于多酚類物質均含有酚羥基，具有一定的極性。萃取溶劑的極性過大或者過小均對多酚得率具有一定的影響。當夾帶劑中乙醇濃度過低時，含水量大，造成萃取溶劑的極性過大；當乙醇濃度過高時，萃取溶劑的極性又過小，因此高乙醇濃度及低乙醇濃度的夾帶劑均不能將一定極性的多酚全部萃取出來，造成多酚得率較低。含70%乙醇的夾帶劑，極性更為適中，對具有特定極性的多酚具有較高的提取效率。

圖1 乙醇濃度對多酚得率的影響

2.1.2 萃取壓力對多酚得率的影響 萃取溫度為50 ℃，萃取時間為2 h，以70%乙醇(體積分數)的水溶液為夾帶劑，夾帶劑流速為0.4 mL/min，考察萃取壓力對綠蘿花中多酚萃取得率的影響，結果見圖2。

圖2 萃取壓力對多酚得率的影響

由圖2可知，多酚得率隨著萃取壓力的增大而增加，這是由于超臨界流體的密度隨著壓力的增加而增加，尤其是在低壓段，密度隨壓力的變化更為敏感[13]。因此，超臨界流體的溶劑化能力也隨密度增加而增強，對多酚的溶解能力也增大，從而多酚得率增加。此外，過高的壓力對設備的要求更高，動力消耗更大。因此，萃取壓力以30 MPa左右為宜。

2.1.3 萃取溫度對多酚得率的影響 提取壓力為30 MPa，萃取時間為2 h，以70%乙醇(體積分數)的水溶液為夾帶劑，夾帶劑流速為0.4 mL/min，考察萃取溫度對綠蘿花中多酚萃取得率的影響，結果見圖3。

圖3 萃取溫度對多酚得率的影響

由圖3可知，溫度上升，多酚得率先上升，>50 ℃時又下降。這主要是由于溫度對萃取效果具有雙重影響：首先，隨著溫度升高，超臨界流體的擴散系數與溶質的揮發性增加，使得溶質與溶劑間的傳質效率增強，對溶質的溶解萃取有正影響；另一方面，隨著溫度增加，超臨界流體密度下降，對溶質的溶解萃取有不利影響。因此，50 ℃為較適宜的萃取溫度。

2.1.4 萃取時間對多酚得率的影響 提取壓力為30 MPa，萃取溫度50 ℃、70%乙醇(體積分數)的水溶液為夾帶劑，夾帶劑流速為0.4 mL/min，考察萃取時間對綠蘿花中多酚萃取得率的影響，結果見圖4。

圖4 萃取時間對多酚得率的影響

由圖4可知，多酚得率隨著萃取時間的增大而增大，這主要是由于多酚在超臨界流體中溶解隨著時間增加而更加充分。然而，萃取時間若長于2 h后，由于多酚在萃取劑中溶解達到平衡，造成多酚的得率緩慢增加。而當萃取時間超過2.5 h，多酚得率略有下降，這可能是由于萃取時間過長，多酚類物質氧化或分解。綜合考慮，選擇提取時間為2 h。

2.2 響應面優化實驗

在單因素實驗的基礎上，選擇萃取壓力、萃取溫度、夾帶劑乙醇濃度為實驗因素，以多酚萃取得率為評價指標，設計了3因素3水平的Box-Behnken響應面實驗，因素水平見表1。

表1 響應面因素水平表

2.2.1 模型建立及模型方差分析 響應面的設計與結果見表2，為了估計實驗誤差，本次實驗中共進行了5次中心實驗。采用Design expertV 8.06 軟件對表2的實驗數據進行多元回歸擬合，得到萃取壓力(A)、萃取溫度(B)、夾帶劑濃度(C)與多酚得率間的二次多項回歸模型為：Y=-84.102 94+0.392 35A+1.820 28B+1.307 75C-4×10-5AB-4.862 5×10-4AC+1.223 75×10-3BC-6.4×10-3A2-0.018 865B2-0.010 112C2，方差分析見表3。

表2 響應面實驗設計與結果

表3 回歸模型方差分析

2.2.2 多酚得率的響應曲面分析 根據擬合模型，利用Design expert軟件繪制交互因子的響應面及其等高線圖，見圖5～圖7，顯示了萃取壓力(A)、萃取溫度(B)、夾帶劑濃度(C)中任意一個變量取零水平時，其余兩個變量對多酚得率的影響。

圖5 萃取壓力和萃取溫度對多酚得率的影響

圖6 萃取壓力和乙醇濃度對多酚得率的影響

圖7 萃取溫度和乙醇濃度對多酚得率的影響

圖5為當采用含70%乙醇(體積分率)的乙醇水溶液為夾帶劑時，萃取壓力和萃取溫度對綠蘿花中多酚萃取得率的影響。

當萃取溫度一定時，多酚得率隨著萃取壓力的增加而增加；而當萃取壓力一定時，隨著萃取溫度變化，多酚得率先增加后減小。這說明響應面的最高點，即等高線中最小橢圓的中心點為實驗范圍的最大值。

圖6為當萃取溫度為50 ℃時，萃取壓力和乙醇濃度對多酚得率的影響。

當乙醇濃度一定時，多酚得率同樣隨著萃取壓力的增加而增加；當萃取壓力一定時，隨著乙醇濃度的增加，多酚得率先增加后減小。同時可以看出，多酚得率隨著乙醇濃度的變化幅度明顯高于隨萃取壓力的變化幅度。此外，從等高線圖也可以看出，沿乙醇濃度軸的等高線密度變化相對沿壓力軸的變化大。以上均可說明夾帶劑濃度對多酚得率的影響比壓力顯著，與方差分析結果相符合。

圖7為當萃取壓力為20 MPa時，萃取溫度和乙醇濃度對多酚得率的影響。當乙醇濃度一定時，隨萃取溫度的變化，多酚得率先增后減，變化趨勢較平緩；當萃取溫度一定時，多酚先增加后減小，變化幅度陡峭，說明夾帶劑濃度的主效應大于萃取溫度，與方差分析結果相符合。同時，觀察其等高線圖，沿乙醇濃度軸向等高線密集，而沿萃取溫度軸等高線相對稀疏，同樣說明夾帶劑濃度對多酚得率的影響高于萃取溫度。

2.2.3 最佳工藝條件的預測及實驗驗證 運用Design expert軟件對綠蘿花多酚得率二次多項回歸模型進行最優化求解，得到最優最佳工藝條件為：萃取壓力為27.94 MPa、萃取溫度為50.39 ℃、夾帶劑為含67.4%乙醇(體積分率)的乙醇水溶液。在此條件下，多酚理論得率為11.077 8 mg/g。為便于實驗操作，將各條件調整為萃取壓力為28 MPa，萃取溫度為50.4 ℃，夾帶劑為67%乙醇(體積分率)的乙醇水溶液，在此條件下進行驗證，測得綠蘿花中多酚得率為(11.015±0.15)mg/g，與理論值相比誤差僅為0.56%，說明該模型擬合度較高、有效可行。

3 結論

超臨界CO2萃取綠蘿花中多酚的最佳工藝條件為：萃取壓力為28 MPa，萃取溫度為50.4 ℃，夾帶劑為67%乙醇(體積分率)的水溶液。在此條件下，多酚得率達(11.015±0.15)mg/g，與理論值誤差0.56%。