基于RAD測序技術的瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachellii)微衛星標記的開發

王青云 郭穩杰 成為為 鄧國喬 徐洪亮 夏儒龍

(1 武漢市農業科學院，武漢 430207；2 華中農業大學水產學院，武漢 430070)

瓦氏黃顙魚(Pelteobagrusvachellii)隸屬于鲇形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)、黃顙魚屬(Pelteobagrus)，是黃顙魚屬中個體最大、生長最快的類群，主要分布于長江及其支流中[1]。該魚因肉質細嫩、味道鮮美、少肌間刺、營養價值高等優點而備受消費者的青睞[2]。但是近些年，由于生境惡化和過度捕撈等原因，瓦氏黃顙魚野生資源遭到嚴重破壞，其種質資源也面臨巨大威脅[3]。良種選育是我國瓦氏黃顙魚養殖產業健康與可持續發展亟待解決的重要內容之一，而在良種選育過程中，對其遺傳多樣性和系譜信息的掌握是至關重要的。

微衛星標記(microsatellite)又稱為簡單序列重復(simple sequence repeats，SSR)，因具有共顯性、多態性豐富、遵循孟德爾遺傳、易于檢測等優點，現已被廣泛用于群體遺傳學[4]、親子鑒定[5]、遺傳圖譜構建[6]和基因定位研究[7]等領域。近年來，新一代高通量測序技術和生物信息學分析方法的發展，使得低廉且高效地獲得SSR標記序列成為可能。目前已利用高通量測序技術對黃顙魚 (Pelteobagrusfulvidraco)[8]、莖柔魚(Dosidicusgigas)[9]、大刺鰍 (Mastacembelusarmatus)[10]等物種進行了SSR標記的開發。本研究采用RAD(restriction association site DNA)簡化基因組測序技術開發瓦氏黃顙魚的SSR標記，以期為瓦氏黃顙魚分子標記輔助育種提供可用的分子標記。

1 材料和方法

1.1 瓦氏黃顙魚樣本采集

研究所用的30個瓦氏黃顙魚樣本全部采自長江武漢段，剪取部分魚的尾鰭后將其放生，尾鰭樣本用無水酒精固定后于-20 ℃冷凍保存備用。基因組DNA采用TIANGEN[天根生化科技(北京)有限公司]試劑盒提取。

1.2 RAD文庫構建和測序

隨機選取8個瓦氏黃顙魚樣本送交廣州基迪奧生物科技有限公司構建RAD簡化基因組文庫，采用Illumina Hiseq 2500進行測序。

1.3 SSR位點鑒別

將8個樣品的高質量測序數據進行聚類，拼接組裝獲得contig序列后，使用軟件MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對所有contig序列進行SSR鑒別，鑒別標準為2、3、4、5、6堿基的重復次數至少為6、5、4、4、4。

1.4 SSR引物設計與多態性篩選

鑒定出的SSR位點采用primer 3引物設計工具(http://bioinfo.ut.ee/primer3/)進行批量設計。隨機挑選25對SSR重復次數相對較多的引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司進行合成。

用8個瓦氏黃顙魚DNA模板對合成引物進行初步篩選和條件優化，優化后的引物進行熒光標記后以30個個體DNA為模板進行PCR擴增，擴增后的PCR產物采用毛細管電泳進行多態性篩選。PCR反應體系包括：2×PCR Mix 10 μL，DNA模板1 μL(50 ng/μL)，5 mmol/L引物對各0.5 μL，超純水8 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸40 s，循環34次；72 ℃延伸7 min。PCR產物送武漢天一輝遠生物科技有限公司采用ABI 3730XL進行基因型分析。

1.5 數據統計及分析

根據統計的基因型數據，用PopGen 32軟件[11]計算微衛星位點等位基因數(Na)；采用MS-TOOLS[12]分析觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)及多態信息含量 (polymorphic information content，PIC)；用ARLEQUIN version 3.1 軟件[13]檢測各位點是否偏離哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)。

2 結果

2.1 瓦氏黃顙魚RAD簡化基因組SSR分析

序列組裝和拼接后共獲得2 275 778條contig序列，利用MISA對所得的contig序列進行微衛星片段搜索，共檢測到466 983個SSR位點，其中二堿基重復位點最多(335 095個)，主要是AC/GT(占49.8%)，其次是四堿基重復位點(84 703個)，主要是AATG/CATT(占3.9%)；剩余依次是三堿基重復位點(31 271個)、五堿基重復位點(13 661個)和六堿基重復位點(2 253個)。相關信息詳見圖1和表1。

圖1 SSR重復單元分類和分布頻率統計Fig.1 Characterization and frequency of microsatellites with different motif sizes

表1 微衛星重復類型統計表Tab.1 Statistics information of microsatellites with different motif sizes

2.2 瓦氏黃顙魚SSRs多態性篩選和檢測

本研究從被篩選出的結果中隨機選取SSR重復次數相對較多的25對引物，對武漢江段8個瓦氏黃顙魚DNA樣本進行PCR擴增，經優化后，有19對引物能較好地擴增出產物，且產物大小與預期擴增目的片段大小一致。用30個瓦氏黃顙魚樣本對擴增出目標產物的引物進行多態性驗證，其中13個位點呈現出多態性(見表2)。

表2 瓦氏黃顙魚多態性微衛星引物序列信息Tab.2 Information of polymorphic microsatellite markers isolated from Pelteobagrus vachelli

13個位點共檢測到184個等位基因，各位點等位基因數(Na)在11～21個，平均為14.2個；各位點觀察雜合度(Ho)在0.700～1.00，平均為0.874；期望雜合度(He)在0.871～0.933，平均為0.905；平均多肽信息含量(PIC)為0.880，所有位點均屬于高多態性位點(PIC>0.5)。除位點PV6和PV7顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(0.01

3 討論

傳統SSR開發方法往往需要構建基因組富集文庫、雜交篩選和測序等步驟，過程比較耗時費力，如今高通量測序技術的飛速發展以及成本的急劇降低為SSR標記的開發創造了較好的條件，該技術具有開發周期短、得率高、靈活性好等優點[14]。近年來，利用RAD簡化基因組測序開發SSR標記的技術日益成熟，相關研究報道也越來越多。劉連為等[9]對莖柔魚(D.gigas)進行了RAD簡化基因組測序，覆蓋度為2X，結果表明，可進行引物設計的SSR位點有5 177個，在隨機合成的100對引物中，有60對引物擴增出清晰條帶，其中39對引物擴增出的條帶呈現多態性。屈政委等[15]采用RAD-seq對印尼虎魚(Datnioidespulcher)進行簡化基因組測序，經序列分析，共檢測到26 359個SSR位點，并成功開發出20個多態性的SSR位點。本研究通過分析瓦氏黃顙魚RAD簡化基因組測序數據，共鑒定出466 983個SSR位點，在此基礎上，后續所要做的工作相對比較簡單，只需要進行PCR擴增以檢驗其是否具有多態性即可。因此，基于RAD簡化基因組測序進行SSR標記開發具有很好的應用前景。

目前已報道的瓦氏黃顙魚SSR標記數量很少，均來自同屬黃顙魚的跨種擴增[16]，尚未見到基于高通量測序技術大量開發瓦氏黃顙魚SSR標記的報道。本研究通過對瓦氏黃顙魚RAD簡化基因組序列進行分析，共設計出了414 484對符合引物開發條件的SSR候選引物。為了進一步檢驗引物的開發質量及開發效率，利用熒光PCR毛細管電泳對其中25對引物進行了電泳檢測。檢測結果表明，在25對引物中，有13對為多態性引物，且均為高多態性引物(PIC>0.5)[17]，這可能與選擇的SSR重復次數相對較多有關。這13個具有高度多態性的位點今后可直接應用于瓦氏黃顙魚群體遺傳學、親子鑒定、分子標記輔助育種等方面研究中。