環境激素對魚類生殖毒性的研究進展

劉曉東 王韓信 蘇明

(1 上海市水產研究所，上海市水產技術推廣站，上海 200433；2 上海市青浦區水產技術推廣站，上海 201700)

根據《2019中國生態環境狀況公報》和《2019年中國海洋生態環境狀況公報》，全國地表水監測的1 931個水質斷面(點位)中，Ⅰ～Ⅲ類地表水占74.9%，與2018年相比上升3.9%；劣Ⅴ類地表水占3.4%，同比下降了3.3%。海洋環境方面，Ⅰ類水質海域面積占管轄海域面積的97.0%，比2018年上升0.7%；劣Ⅳ類水質海域面積28 340 km2，比上年減少4 930 km2。數據表明，我國水環境質量持續改善，海洋水環境穩中向好[1]。但有一些污染物很難降解，將會長期存在，還有很多已知的污染物短期內難以徹底禁用，此外還有更多的新型化合物在不斷面世，這些都是環境的監管和保護仍要面臨的嚴峻挑戰。

環境激素 (endocrine disruptors or endocrine disrupting chemicals)在水體中具有持久性或偽持久性，會影響水生動物的性別分化，導致性逆轉、性腺異常發育、生殖機能和行為異常，從而造成種群數量下降甚至滅絕[2-3]。同時，環境激素還會通過食物鏈的傳遞影響人類健康，導致人類發育異常、生殖功能障礙等[4]。魚類是水體中環境激素的直接暴露者，又是人類重要的動物蛋白來源。因此，無論從環境保護、生態安全或是食品安全角度來看，開展環境激素對魚類生殖毒性的研究均具有重要意義。另外，生殖性功能異常也是化合物評價的重要指標之一[5-8]，而魚類是該領域研究的重要模式物種[9]。因此，筆者檢索、整理了近年來該領域的相關研究成果，綜述水環境激素的種類及其對魚類毒理、生殖毒性的常用研究方法，并以有機錫污染物為例，細述環境激素對魚類生殖的影響，并提出未來研究的展望。

1 常見的環境激素

水體中的環境激素種類繁多，結構各異，一般按其來源不同可分為天然化合物和人工合成物。前者包括天然雌激素、微囊藻毒素等。絕大多數環境激素來自工農業生產等人類活動排放的污染物及其代謝降解產物，包括除草劑、殺蟲劑、藥物、工業化合物和重金屬等(見表1)[10-32]。

表1 水體中常見的環境激素及其毒性機理Tab.1 Widespread endocrine disruptors and their toxic mechanism

2 魚類生殖毒理研究方法

體內實驗是魚類生殖毒理研究中常用的傳統方法。體內實驗中，實驗對象及其發育階段，暴露方式等是關鍵影響因素。近年來，隨著相關技術理論的發展，體外實驗也受到越來越多的重視和應用。另外，由于野外環境的復雜性，模擬實驗常常無法完全反映野外的真實情況，因此，開展野外實驗意義重大。

2.1 體內實驗

2.1.1 實驗對象

多數魚類為體外受精，體外發育，且胚體透明，便于開展生殖毒性研究，對魚類生殖毒理的研究結果可在很大程度上用于預測對脊椎動物的影響[33]。因此，早在20世紀40年代，一些魚類就被廣泛用于毒理研究，其中主要是鮭科魚類(Salmonidae)、太陽魚(Lepomismacrochirus)、金魚(Carassiusauratus)等大型魚類。20世紀60—70年代，為了便于開展長期暴露實驗，開始更多地采用繁殖周期較短的小型魚類[9]，如黑頭軟口鰷(Pimephalespromelas)、斑馬魚(Daniorerio)和青鳉(Oryziaslatipes)，這3種小型魚類都具有性成熟時間短、產卵間隔短、容易飼養、適合小型水體培養、對毒物敏感等先天優勢，同時其發育、遺傳、基因組、免疫等基礎研究數據豐富，并已建立了多種穩定的品系[33-34]，已成為國際普遍認可的毒理學研究模式生物，廣泛應用于環境激素篩選，也是經濟合作與發展組織(OECD)化合物測試系列導則中魚類繁殖試驗推薦的受試魚類(見表2)[5-8]。

表2 OECD化學品測試導則中魚類生殖試驗方法Tab.2 Experiment design for fish reproduction assay in OECD guidelines for the testing of chemicals

近年來，我國特有的小型鯉科魚類稀有魚句鯽(Gobiocyprisrarus)也逐漸成為重要的模式生物。稀有魚句鯽同樣具有產卵間隔短、性成熟時間短、適合小型水體培養等先天優勢。而且，我國科研工作者從1990年起，就以培育新的實驗動物為目的，對稀有魚句鯽開展了多學科的系統研究，建立了近交系和野生封閉群2個品系，探明了其對重金屬、揮發性有機物、苯胺類、含氯消毒劑、農藥等污染物普遍敏感，陸續研究制定了使用稀有魚句鯽作為毒性試驗材料魚的相關標準和規范，生態環境部也已將稀有魚句鯽列為新的化學物質測試推薦魚種[34-36]。采用稀有魚句鯽為受試對象的相關研究越來越多[29,37]，作為土著魚類，它具有更好的代表性，更加具有生態指示意義[38]。

因為土著魚類本身就是重要的保護對象，所以開展土著魚類的毒理研究，對特定污染事件或特定生物群落、特定生態系統的研究，以及對水環境基準的制定都是非常必要的。2017年，我國環保部發布的《淡水水生生物水質基準制定技術指南》中，推薦的受試魚類除國際通用的模式生物外，還包括10種我國廣泛分布的土著魚類[39]。近年來，我國學者從生態和物種保護、食品安全以及服務養殖生產等角度開展了大量關于土著魚類的毒理學相關研究。例如，趙巖等[40]報道了BPA對雄性泥鰍卵黃蛋白原(Vtg)水平的影響和誘導Vtg的最低濃度(1 μg/L)，呂雪飛等[41]報道了BPA與E2聯合暴露對泥鰍(Misgurnusangaillicaudatus)的Vtg誘導效應。陳玉明等[42]開展了硫酸銅對泥鰍(M.angaillicaudatus)精子活力影響的體外試驗。

2.1.2 暴露方式

生殖毒性實驗常見的暴露方式包括水環境暴露、餌料暴露以及體內注射暴露等。暴露方式會影響魚類對毒物的吸收和累積路徑。Harrison等[43]對虹鱒(Salmogairdneri)和白鮭(Coregonusclupeaformis)的研究表明，通過水環境暴露的鎘(Cd)主要累積在鰓和腎臟，而通過餌料暴露則主要累積在腸道和腎臟；Lee等[44]對尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)的研究表明，經水環境暴露的鉛(Pb)在不同器官的沉積量為腎臟>肝臟>鰓>性腺和脾臟>腦>肌肉，而餌料暴露時則為腸道>胃>肝臟>腎臟>骨骼>鰓>脾臟>精巢>肌肉>腦。暴露方式還會影響毒物在魚體的累積量。例如，Alsop等[45]的研究表明，在水體鉛濃度相同的條件下，單獨水環境暴露導致的虹鱒(Oncorhynchusmykiss)體內鉛的累積量是單獨經餌料(帶絲蚓Lumbriculusvariegatus)暴露的20～60倍。

水環境暴露是魚類生殖毒性研究中最常采用的方式。生殖毒性研究一般都需進行慢性試驗，期間的養殖和維生操作很容易引起水環境變化，從而改變環境激素對魚體的毒性作用。這些水環境因素包括pH、溫度、有機碳、硬度、溶解有機物、富營養化程度等[46-49]。因此，水環境暴露試驗中，養殖和維生操作應盡量減少水質波動，保持環境穩定。

采用注射暴露，環境激素的用量大大減少，但需要逐尾注射。注射操作會使受試魚產生應激反應，而應激反應可能影響多種下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸相關的激素水平[50-51]，從而影響試驗結果。但根據Kahl等[52]的研究報道，在間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)麻醉狀態下，對黑頭軟口鰷(P.promelas)進行1次或在1周內連續3次腹腔空白注射，受試魚除雌魚血漿Vtg水平升高外，其性腺指數(GSI)、卵子受精率和孵化率、雌魚血漿中的雌二醇(E2)水平、雄魚睪酮(T)和11-酮睪酮(KT)水平、雄魚血漿Vtg水平均與空白組無顯著差異，表明注射操作不會干擾試驗結果。這可能是由于注射操作持續時間很短，同時也與具體的操作過程有關。

餌料暴露試驗時，在餌料中添加激素的方式可能會對試驗結果產生重大影響。例如，Hodson等[53]將硝酸鉛混入牛肝，經勻漿、冷凍干燥、粉碎后再混入配合飼料。在32周的試驗中，并未發現受試魚體內有鉛累積，而是全部通過糞便排出。但此后采用其他餌料載體進行鉛暴露的研究表明，餌料暴露會導致魚體內鉛的累積[44-45]，說明是由于添加方式而導致鉛未被受試魚吸收。

2.1.3 發育階段

魚類早期發育階段是對環境激素的敏感時期[33]，往往低劑量的暴露就會對性腺分化產生不可逆轉的影響；繁殖階段的暴露會影響親本繁殖力、卵子的質量和受精率、受精卵的孵化率以及子代的成活和生長發育。例如，Mcallister[54]研究表明，斑馬魚(D.rerio)仔魚經極低濃度(0.01 ng/L)的三丁基錫(TBT)暴露，群體雄性比例明顯提高；Nimrod[55]對青鳉(O.latipes)的研究也表明，仔魚經0.01 μg/L的低濃度E2暴露后，全部轉變為雌性。Kang等[56]對繁殖期的青鳉(O.latipes)進行E2暴露，導致產卵數量減少、受精率降低，雄魚出現性腺間性和Vtg水平顯著升高現象。

全生命周期、甚至多代實驗對全面了解環境激素對魚類的影響非常重要。魚類全生命周期實驗一般指暴露期從24 h以內的胚胎直到性成熟并繁殖，或者直到子代發育至幼魚階段。Chen等[57]研究指出，對于不同階段的斑馬魚，BPA暴露對其精液量、精子密度和活力、子代的畸形率的影響不同。Ma等[58]、Xie等[59]開展了2-溴-4，6-二硝基苯胺(DBNA)對斑馬魚毒性的多代暴露實驗，結果表明，親代暴露會對F0、F1和F2代分別產生不同的影響。

2.2 體外實驗

體外實驗可以更好地開展作用靶位、毒性機理及遺傳毒性等研究，能夠以低成本開展高通量的污染物篩選，同時也更符合動物實驗中減少(Replacement)、替代(Reduction)、優化(Refinement)的3R原則[60]。對精子活力和功能影響的研究常采用體外實驗。Hatef等[61]綜述了污染物對魚類精子功能的影響：污染物通過破壞精子質膜、軸絲、干擾能量代謝、破壞運動器官等影響精子活動能力、活動時間、運動速率以及受精能力，歸納出受試精子的質量、體液污染、精液的保護作用、精子活力和受精能力在繁殖季節期間的變動情況，指出實驗條件控制是影響精子體外實驗結果的關鍵因素。

雌激素受體也是較為常用的環境激素體外實驗工具。Chakraborty等[62]研究了DDT、E2、硫丹、雙甲脒、樂果、七氯、溴氰菊酯、高滅磷、多菌靈等多種環境激素對青鳉(O.latipes)3種雌激素受體的影響，并結合體內實驗分析了3種受體在青鳉生殖發育中的功能及外源E2的影響機制。Lange等[63]比較了多種天然和人工合成雌激素對模式生物斑馬魚(D.rerio)、青鳉(O.latipes)、黑頭軟口鰷(P.promelas)、三刺魚(G.aculeatus)以及環境監測中常用的鯉魚(Cyprinus.carpio)和虹鱒(O.mykiss)雌激素受體的敏感性，并證明了體外受體激動效應與傳統的指標Vtg誘導效應的良好相關性。目前，利用體外實驗開展污染物篩選和毒理研究仍面臨一些困難和挑戰，例如，對很多環境激素體內作用途徑和毒理學終點并不足夠清晰，尚需針對不同的細胞或細胞系建立特定的標準化模擬生理環境，以及大量環境激素的環境行為基礎數據[64-65]。

2.3 野外實驗

根據實驗室模擬實驗的結論推導自然條件下毒物對生物的影響是生態毒理學中常用的研究方法[9]。但是，模擬試驗的環境條件相對簡單且穩定，而野外條件復雜，涉及環境激素的環境行為、相互作用、環境條件的影響以及生態系統的結構和功能等。例如，水環境中的無機汞很少被魚類直接吸收，主要是經過微生物和藻類的甲基化作用后進入水生食物鏈后方在魚體內富集，浮游植物和微生物等對汞的富集情況可以較好地預測魚體汞的累積量，水體總有機碳濃度、富營養化狀態等會影響汞的生物富集及其沿食物鏈的生物放大[66-67]。有研究已證實，環境中的多氯聯苯(PCBs)會在羅非魚體內富集[68]。但Barber等[69]發現，在1個PCBs濃度較高的污水處理廠人工濕地內，羅非魚(Tilapiamossambica)體內PCBs的濃度卻極低，這可能是環境條件、食性不同以及多種污染物的相互作用導致的。Dale等[70]通過設置養殖網箱研究了垃圾場附近海域污染物對大西洋鱈魚(Gadusmorhua)的影響，結果表明，富集PCBs最高的鱈魚網箱并不在海底PCBs最高區域，而且雖然PCBs在魚體富集，但檢測PCBs的分子標記Cyp1a在基因表達或蛋白水平方面均無顯著改變。上述研究可見野外實驗的復雜性及其與實驗室研究的差異性。因此，開展野外實驗以及種群和生態系統等宏觀尺度的研究意義重大。但目前這方面的研究相對缺乏。

3 有機錫化合物對魚類生殖的影響

有機錫化合物被廣泛地應用于用于木材、船舶的防腐，是水體中常見的污染物。Jiang等[71]的監測表明，1998—1999年間，中國東南沿海主要港區及滇池、白洋淀等水體的TBT含量在0.8～976.9 ng/L(以錫的量計)，僅有少數監測點濃度低于0.5 ng/L的最低檢出限。有機錫通過抑制雌激素合成途徑關鍵酶、干擾雌激素核受體基因表達等，導致魚類雄性化、破壞性腺和生殖細胞的結構功能、改變正常的生殖行為。以下以TBT、TPT等有機錫污染物為例，綜述其對魚類性生殖的影響。

3.1 導致魚類雄性化

TBT早期暴露會導致不可逆轉的雄性化現象。McAllister等[54]對斑馬魚(Daniorerio)的研究表明，初孵仔魚經TBT暴露70 d，停止暴露至成熟時，群體雄性比例明顯提高。Santos等[72]報道了在TBT與乙炔基雌二醇(EE2)聯合暴露中，EE2抵消TBT引起的斑馬魚雄性化現象，范家誠等[73]的研究表明，E2和TBT同時暴露，當TBT濃度較高時，能夠抑制E2對卵黃蛋白原基因vtg1和雌激素受體基因esr1的表達誘導作用。Shimasaki等[74]用對35～100日齡的褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)進行餌料途徑TBT暴露(添加量為0.1和1.0 μg/g)，結果受試魚的雄性比例明顯提高，同時P450-arom基因表達下降。這些研究說明，TBT作為芳香化酶抑制劑會使雌激素合成受阻，從而導致作用對象雄性化。

3.2 破壞性腺和生殖細胞的結構和功能

TBT對雌、雄魚影響不同。雄魚方面，McAllister等[54]報道了TBT引起斑馬魚(D.rerio)精子鞭毛數量減少、精子活力下降現象；Nakayama等[75]報道了TBT暴露導致青鳉(O.latipes)受精率下降；范立民等[76]報道，氯化三丁基錫(TBT-Cl)導致羅非魚(O.aureus)精巢細胞凋亡率顯著提高。針對TBT會影響精子質量的現象，Thresher等[18]用非類固醇類芳香化酶抑制劑法處理斑馬魚(D.rerio)和青鳉(O.latipes)，結果同樣會導致精子活動能力下降、活動持續時間減少以及精子畸形，證實了此前關于雌激素在精子發育過程中發揮關鍵作用的假說，說明TBT對于精子的影響也與芳香化酶抑制有關。周群芳等[77]對稀有魚句鯽(G.rarus)的研究表明，經TBT-Cl暴露2周，雄魚成熟系數(GSI)顯著提高。但Zhang等[23]在對褐菖鲉(S.marmoratus)的研究中卻發現，TBT暴露導致雄魚GSI下降，同時出現精巢小葉間隔間質纖維化嚴重、支持細胞功能受到破壞、精巢小葉間隔脂肪滴量提高、總脂含量增加等。Sun等[78]也發現，TPT會導致褐菖鲉雄魚GSI下降，精巢組織學改變等類似現象。此外，吳鵬等[79]報道，TBT-CL會導致卵胎生魚類孔雀魚(Poeciliareticulata)雄性生殖足指數增加。

雌魚方面，Xiao等[80]報道，TBT暴露導致斑馬魚(D.rerio)雌魚性腺指數、產卵量、受精卵的孵化率以及仔魚的成活率都顯著下降，卵巢內卵泡總數減少，且早期卵泡比例顯著增加，發育后期卵泡明顯減少。Zhang等[81-82]報道，TBT暴露導致褐菖鲉(S.marmoratus)雌魚卵黃生成期卵泡比例下降，早期的卵泡比例上升，卵泡凋亡顯著增加，卵巢中性脂質顆粒減少，間質異位脂質和總脂升高，卵巢和卵母細胞的功能受到影響。Horie等[83]對于青鳉(O.latipes)的研究表明，TBT會導致雌魚肝臟Vtg水平和產卵量顯著降低。此外，Zhang等[84]從TBT對雌、雄魚芳香化酶Cyp19b、雌激素受體基因ERα、ERβ等相關基因表達的不同影響方面報道了TBT影響的性別差異性。

3.3 影響生殖行為

有機錫化合物還會影響魚類的生殖行為。Zhang等[85]研究發現，TPT暴露會使孔雀魚(P.reticulata)雄魚的“sneaking attempts”行為(即從后方追逐雌魚并試圖交配的行為)出現頻率顯著增加，這可能與TBT導致其體內T水平上升有關。但雄魚皮膚類胡蘿卜素含量下降，體色變暗，對雌魚的吸引力降低。這可能是TBT導致體內氧化應激，消耗了類胡蘿卜素所致，表明TBT還可能通過引起氧化應激等其他途徑導致魚類生殖異常。Xiao等[80]也報道了斑馬魚(D.rerio)經TBT暴露后，雌、雄魚在產卵區停留時間都明顯減少的現象。Nakayama等[75]對青鳉(O.latipes)進行TBT以及TBT和PCBs聯合暴露后，發現主動求偶的雄魚數量以及雄魚求偶行為的出現頻率都顯著降低。魚類生殖行為與體內類固醇激素以及生物信息素等的調控有關[86-87]。但目前有關環境激素對生殖行為的影響機制的研究，特別是對生物信息素的影響研究較少。

3.4 對子代的影響

有機錫污染物會致染色體畸變、DNA損傷[88-89]，并且會通過在卵子中的累積直接傳遞給下一代，導致魚類子代畸形、繁殖力下降等。Horie等[81]報道，TPT暴露導致青鳉(O.latipes)F0和F1代產卵數量、受精率及肝臟Vtg水平下降，并且相對于F0代，F1代在更低的濃度組出現上述反應，認為這是由于TPT從親本到子代的累積傳遞所致。但該研究在1.0～3.2 μg/L的暴露濃度范圍內沒有觀察到性腺組織學方面的異常。Zhang等[90]在更低的暴露濃度下(1.6～1 000.0 ng/L)對青鳉親本進行TPT暴露5周后，親本Vtg基因表達下調，導致卵黃累積不足，卵子質量下降，子代出現胚胎發育期間血管出血、眼部畸形或無眼、脊柱彎曲以及連體、卵巢中成熟卵母細胞數量減少以及卵泡鎖閉等現象，并且在暴露結束后在卵子中檢測到TPT，說明TPT會通過母體向子代傳遞。吳鵬等[79]對孔雀魚(P.reticulata)的研究中也觀察到TBT-Cl暴露會導致子代脊柱彎曲和卵黃囊腫發生率顯著提高現象。

4 展望

為保護生態環境與資源，確保食品安全和人類健康，筆者認為，今后應在以下4個方面加強研究：(1)結合地區氣候特點和污染現狀，加強環境激素的環境行為和不同環境激素之間相互作用的相關研究，更好地將實驗室研究成果應用于環境和資源保護；(2)養殖魚類直接關乎人體健康，我國養殖魚類種類繁多，相應的養殖模式也多樣化。針對養殖魚類，結合養殖環境開展的相關研究尤顯不足，應當加強；(3)新型化合物、藥物等不斷加速面世，帶來了更多潛在的健康和環境風險，應加速開展針對新型化合物的環境行為和毒理效應等相關研究；(4)應注重綜合生態學、生物學、化學等相關學科的最新研究成果，開發新的研究技術和設備，推進環境激素研究不斷深入。