芍藥苷對動脈粥樣硬化小鼠主動脈斑塊、血脂及DNA甲基化的影響

【摘要】目的：探討芍藥苷對動脈粥樣硬化小鼠模型主動脈斑塊、血脂、血清甲基化及DNA甲基轉移酶水平的影響。方法：30 只 8 周齡雄性 ApoE-/-小鼠高脂喂養9周后，隨機分為模型組、立普妥組（陽性對照組）和芍藥苷組。繼續喂養并藥物干預9周后，分別檢測三組小鼠血脂、血清 DNA 甲基化水平及 DNMT1水平;行HE染色，采用 IPP 圖像分析軟件測量小鼠主動脈斑塊面積。結果：芍藥苷可減小動脈粥樣硬化小鼠主動脈斑塊性對面積，降低血清TG、LDL-C水平，并降低血清DNA甲基化及DNMTI水平。結論：芍藥苷可通過降低血脂、血清甲基化及DNMT1 水平從而抑制動脈粥樣硬化斑塊形成，干預動脈粥樣硬化進展。

【關鍵詞】芍藥苷;動脈粥樣硬化;血脂;甲基化;DNA甲基化轉移酶

中圖分類號：R285.5

前言

心血管疾病是引起人類死亡的首要原因;據統計，在我國因病死亡人數中約2/5死于心血管疾病。動脈粥樣硬化是包括冠狀動脈粥樣性心臟病在內的諸多心血管疾病的病理基礎，因此有效緩解動脈粥樣硬化是預防及治療心血管疾病的基礎。在動脈粥樣硬化的發生過程中，脂代謝紊亂發揮著重要的作用;而DNA甲基化與脂代謝紊亂具有密切關系。芍藥苷是中藥赤芍的主要苷類化合物之一;研究表明，芍藥苷具有顯著的抗氧化能力及降脂和抑制主動脈斑塊形成的作用。本實驗以高脂飲食喂養的ApoE -/- 小鼠為觀察對象，探討芍藥苷對動脈粥樣硬化模型小鼠的主動脈斑塊、血脂及DNA甲基化的影響。

1.材料與方法

1.1 動物與飼料

30只6-8周齡ApoE-/-小鼠（雄性，品系C57BL/6J），體重約18-20g，購自北京維通利華實驗技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001。高脂飼料：21%脂肪（wt/wt）、0.15%膽固醇（wt/wt），購于北京科奧協力飼料有限公司，許可證號：SCXK（京）2009-0012。

1.2 藥物

芍藥苷購自澤朗醫藥公司生產（批號：20140315）;阿托伐他汀鈣（商品名立普妥）購自輝瑞制藥有限公司（批號：H20051408）。

1.3 分組及模型的制備

所有小鼠飼養于SPF級動物室，正常飼料適應性喂養3日后，ApoE-/-小鼠更換為高脂飼料，自由采食攝水。9周后，隨機分為模型組、立普妥組，芍藥苷組（n=10）。據成人臨床推薦日用量，按體重系數比折算小鼠給藥量：立普妥3mg/kg ，芍藥苷0.12g/kg（折算系數為9.01，公式：成人日用量/60kg×9.01=小鼠日用量/kg）。藥物溶解于蒸餾水中，每日灌胃給藥1次，模型組給予等量蒸餾水灌胃，繼續高脂喂養9周。

1.4 血脂的檢測

嚴格按照試劑盒說明書，檢測血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。

1.5 血清DNA甲基化及DNA甲基轉移酶水平的檢測

嚴格按照試劑盒說明書，采用 ELISA 法檢測DNA 甲基化轉移酶（DNMT）水平。采用高效液相色譜法（HPLC）檢測血清 DNA 甲基化水平。

1.6 主動脈斑塊面積的測定

無菌條件下取各組小鼠心臟，經脫水、包埋、切片，按照Suzuki等建立的方法，取小鼠主動脈瓣起始橫斷面，每隔100μm取4張切片，切片厚5μm。行HE 染色，后使用IPP軟件測量各只小鼠斑塊面積，后計算斑塊占占管腔百分比。

1.7 統計學方法

實驗數據以均數±標準差（ ±s）表示。使用GraphPad Prism6.01軟件對數據進行統計分析。兩組間采用t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析，p﹤0.05表示差異有統計學意義。

2.結果

2.1 動脈粥樣硬化小鼠模型的建立及芍藥苷對主動脈斑塊的影響

藥物干預9周后，模型組小鼠主動脈根部可見明顯動脈粥樣硬化斑塊，伴大量膽固醇結晶伴泡沫細胞聚集（圖1A）。立普妥組（圖1B）及芍藥苷組（圖1C）斑塊相對面積較模型組顯著減小，立普妥組斑塊相對面積較芍藥苷組顯著降低，差異有統計學意義（表1）。

2.2 芍藥苷對動脈粥樣硬化模型小鼠血脂的影響

藥物干預9周后，與模型組相比，立普妥及芍藥苷可顯著降低血清TG與LDL-C水平;但立普妥降低甘油三酯水平較芍藥苷更為顯著;芍藥苷可顯著升高血清HDL-C水平。（表2）

2.3 芍藥苷降低動脈粥樣硬化模型小鼠血清DNA甲基化水平及DNMT1水平

藥物干預 9周后，立普妥組及芍藥苷組小鼠血清DNA甲基化水平較模型組明顯降低;立普妥組與芍藥苷組之間無明顯差異。立普妥組與芍藥苷組小鼠血清DNMT水平較模型組亦明顯降低（P<0.01），兩組間無明顯差異。（表3）

3.討論

芍藥苷為常用傳統中藥芍藥的主要有效成分，是一種單萜類糖苷化合物，具有廣泛的藥理作用。研究表明，芍藥苷具有抗氧化，抗炎，抗凝、抗高血糖、降血脂及抗動脈硬化等多種生物學效應，且毒副作用較小。動脈粥樣硬化是以脂代謝紊亂為主要病因的一類病理性血管疾病;自1999年以來，動脈粥樣硬化被認為是一種慢性炎癥病變，而脂代謝紊亂則被認為是血管內膜炎癥反應的發生關鍵因素，在As過程中發揮著重要作用。

DNA甲基化是表觀遺傳學的一種重要方式，在維持生物體多種正常功能及疾病的發生、發展中發揮著重要作用。研究證實，在脂代謝紊亂過程中與脂代謝密切相關的多種基因存在著DNA甲基化現象。另外，DNA 甲基化可通過調控與AS有關的炎癥免疫細胞和炎癥因子來影響 AS 的發生與發展。基因組甲基化水平與冠心病及冠心病風險呈正相關。

本研究以高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠制備動脈粥樣硬化模型，經藥物干預治療后檢測其血脂、主動脈斑塊相對面積及血清DNA甲基化及DNMT1水平以探討芍藥苷對動脈粥樣硬化的作用。結果可見：芍藥苷可有效降低動脈粥樣硬化小鼠血清TG及LDL-C水平，并可增加HDL-C水平，此種作用可能是芍藥苷發揮抗動脈粥樣硬化作用的基礎。而芍藥苷降低基因組DNA甲基化水平及DNMT1水平可能是其發揮降低血脂的途徑之一;但其具體機制仍待進一步研究。

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