HBV-C基因型復制細胞系的構建與鑒定

李瑞明 楊燕 曾憲煌 孟忠吉

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是導致慢性肝炎、肝硬化和肝細胞肝癌的重要原因之一[1-2]。核苷(酸)類似物[nucleos(t)ide analogues, NAs]廣泛應用于乙型肝炎的治療，大多數患者需要長期治療甚至終身治療，但是隨著治療時間的延長，產生HBV耐藥性突變的風險會隨之增加[3-5]。本研究旨在建立HBV臨床分離株的體外復制穩定表達系統，研究其特征及其耐藥機制，并針對不同患者體外篩選有效的抗HBV藥物。

材料與方法

一、 實驗材料

乙肝病毒全長基因組PCR擴增產物由本研究所從乙型肝炎患者血清中克隆擴增獲得，在之前的文章中已經報道[6]，參照Gunther等[7]設計引物及Durantel等[8]的HBV全長PCR參數，擴增出HBV全長基因組DNA。

質粒pcDNA3.0(-)-EGFP-ΔCMV由本研究所構建并保存，通過反向PCR刪除了CMV啟動子，并在轉錄終止序列BGH-pA的下游插入完整的綠色熒光蛋白(EGFP)表達框(圖1)；大腸桿菌DH5a感受態購自北京天根生化科技有限公司。

PCR擴增儀(美國Bio-Rad)，酶標儀(德國Eppendorf)，定量PCR儀(美國ABI stepone plus)，Chamber Slides(美國Thermo Fisher Scientific)；限制性內切酶T4 DNA連接酶購自New England Biolabs公司；高保真DNA聚合酶、DIG DNA Labeling and Detection Kit購自羅氏公司；DMEM培養基、脂質體Lipofectamine 2000、胎牛血清、G418(50 mg/mL)購自Invitrogen公司； DNA提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒、定量PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；HBsAg和HBeAg EILISA檢測試劑盒購自科美公司；HBcAg和HBsAg抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

人肝癌細胞系HepG2和HepG2.2.15細胞系均為本室保存。

二、研究方法

(一) 引物設計 使用Vector Nti設計所需要引物，并由擎科生物公司合成。擴增0.2拷貝HBV 引物序列：pcDNA-232-HBV-2795-NotI-U tacggg-ccagatatacgcggccgcggatcctgcgcgggacgt，pcDNA-1255-HBV-169-SacI-D aagccatagagcccaccgagctcagatctcgaa-tagaaggaaaaaagtc。擴增1.0拷貝HBV引物序列：HBV-X15-BamHI-U cgcggatcctgcgcgggacgtcctttgtc-ta，HBV-X15-BamHI-D cgcggatccagttggcagcacaccc-tagcagc。

(二) 0.2拷貝及1.0拷貝HBV基因組的擴增 取2 μg HBV全長基因組PCR產物經SapI 37℃酶切4 h，純化后取100 ng回收產物T4 DNA連接酶16℃過夜連接得到環狀HBV全長基因組。取0.5 μL環狀HBV全長基因組(稀釋為200 pg/μL)為模板， 引物(10 μmol/L)各1.5 μL，參照Roche高保真試劑盒說明配制反應體系，PCR擴增HBV全長基因組DNA及0.2拷貝基因組，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產物。

(三) HBV復制型質粒p1.2×HBV-EGFP的構建 0.2拷貝HBV基因組PCR產物經純化后與骨架質粒pcDNA3.0 (-)-EGFP-ΔCMV各2 μg分別用限制性內切酶NotI-HF/SacI-HF 37℃酶切4 h，回收酶切產物及載體，T4 DNA連接酶16℃過夜連接，連接產物轉化DH5a感受態細菌，在Amp抗性平板上篩選陽性克隆。挑取陽性克隆行菌落PCR，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產物，選取陽性菌落培養過夜抽提質粒測序。將上述構建的0.2拷貝質粒2 μg用限制性內切酶BamHI 37℃酶切4 h，回收載體，加入小牛腸堿性磷酸酶(CIP) 0.4 μL，37℃反應1 h充分去磷酸化，過柱純化；同時將1.0拷貝HBV基因組擴增產物2 μg用限制性內切酶BamHI 37℃酶切4 h并過柱純化；將載體與插入片段用T4 DNA連接酶16℃過夜連接，連接產物轉化DH5a感受態細菌，在Amp抗性平板上篩選。挑取陽性克隆做菌落PCR，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產物，選取陽性菌落培養過夜抽提質粒，送上海生工測序。

(四) 細胞培養、質粒轉染及G418篩選 HepG2細胞用含10%胎牛血清(FBS)、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養液，在37℃、5%CO2孵箱中培養。質粒轉染參照LipofectamineTM說明書進行。在24孔板中按1.0×105/孔接種HepG2細胞，培養24 h，每孔轉入0.5 μg p1.2×HBV-EGFP質粒，繼續培養48 h，傳代至T25培養瓶加入含700 μg/mL G418篩選培養基繼續培養2～3周，挑選陽性克隆，進一步傳代培養保種。收集細胞系培養上清和細胞，備檢。

(五) HBsAg和HBeAg的酶聯免疫吸附(ELISA)檢測 培養上清中的HBsAg和HBeAg水平，采用ELISA試劑盒參照說明書進行檢測。

(六) HBV DNA的Realtime PCR檢測 采用天根DP315病毒基因組提取試劑盒抽提細胞培養上清總DNA，Realtime PCR檢測HBV DNA水平，引物序列：PGP_v1 cacctctgcctaatcatctc和BC1_v2 ttatacgggtcaatgtccat，擴增參數：95℃預變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火延伸20 s，循環40次。

(七) 核衣殼相關HBV復制中間體的提取和Southern雜交 核衣殼相關HBV復制中間體的提取見參考文獻[6]。核衣殼相關HBV復制中間體以1.0%的瓊脂糖凝膠分離，然后于轉移緩沖液(0.5 mol/L NaOH,1.5 mol/L NaCl)中轉印到Gene Screen Plus尼龍膜上，與DIG標記的HBV全長探針雜交，采用成像系統分析雜交信號。

(八) HBsAg和HBcAg的免疫熒光檢測 在8孔chamber slide中每孔接種10 000個細胞，37 ℃培養24 h后按標準免疫熒光程序檢測HBcAg、HBsAg，共聚焦顯微鏡采集圖像。

結 果

一、成功構建HBV-C基因型臨床分離株1.2×HBV復制型質粒p1.2×HBV-EGFP p1.2×HBV-EGFP包含的HBV來源于臨床分離株(GeneBank序列號為：KM213037.1)[6]。構建的p1.2×HBV-EGFP質粒經測序驗證序列無突變，其中HBV序列(nt1402-nt3215-nt1989)包含C基因啟動子和增強子II，可以啟動包括pgRNA在內的HBV mRNA轉錄。另外，該1.2×HBV復制型質粒在HBV表達框下又有EGFP表達框，可以表達EGFP(圖1)。

(A)1.2×HBV 基因結構及mRNA示意圖；(B)p1.2×HBV-EGFP質粒結構示意圖

二、成功建立C基因型臨床分離株HBV復制細胞系HepG2X15

G418篩選3周后得到一個穩定表達綠色熒光蛋白的陽性克隆，繼續篩選傳代至第10代，在熒光顯微鏡下可以觀察到幾乎所有的細胞都呈綠色(圖2)，得到一株HBV-C基因型復制細胞系，命名為HepG2X15細胞系，凍存保種。

圖2 HepG2X15細胞的綠色熒光蛋白的表達(40×)

三、HepG2X15細胞表達高水平HBsAg和HBcAg

免疫熒光結果顯示，所有EGFP陽性細胞都能檢測到高水平HBsAg和HBcAg，而且HBsAg和HBcAg在胞漿和胞核均可見，但是以胞核表達為主(圖3)。

圖3 HepG2X15細胞內HBsAg和HBcAg的表達

四、HepG2X15細胞上清中HBsAg和HBeAg的表達

在HepG2X15細胞上清中，ELISA檢測到高水平HBsAg和HBeAg，其中HBsAg高于HepG2.2.15細胞上清，HBeAg略低于HepG2.2.15細胞上清(表1)。

表1 HepG2X15細胞上清中HBsAg和HBeAg的表達

五、HepG2X15細胞產生高水平子代病毒分泌到細胞外

Real-time PCR結果顯示，HepG2X15細胞上清HBV DNA達到108拷貝/mL，略高于HepG2.2.15上清中的HBV DNA水平：(8.18±0.21)×108拷貝/mL vs(6.91±0. 71 )×108拷貝/mL，P>0.05。

六、HepG2X15細胞內檢測到病毒復制中間體

Southern blot檢測核心顆粒相關HBV DNA，結果可見到1～4 kb大小的HBV雜交信號，呈現類似HepG2.2.15細胞核心相關HBVDNA的Southern 雜交信號，即HBV復制中間體，包含松弛環狀DNA(RC)、雙鏈線狀DNA(DL)和單鏈DNA(SS)。HepG2X15細胞內HBV復制中間體水平略低于HepG2.2.15(圖4)。

圖4 HepG2X15細胞內HBV的復制中間體

討 論

當前應用最廣泛的HBV復制細胞系HepG2.2.15[9]和HepAD38[10]細胞系都是基于血清型ayw, 基因型D(GeneBank序列號 U95551)的病毒株建立的。由于B和C基因型的HBV是中國人群感染的主要基因型，不同亞型的病毒感染預后也有很大不同[10-14]，因此有必要建立符合中國人群HBV感染現狀的細胞模型。

在前期研究中，筆者從乙型肝炎患者血清中克隆了5株HBV臨床分離株，其中基因B型3株，基因C型2株，成功將這些病毒株克隆入pHY106復制型質粒，在轉染HepG2及Huh7細胞的上清中檢測到HBsAg、HBeAg及HBV DNA，細胞內檢測到HBV復制中間體[6]。本研究中筆者從其中一株臨床分離株克隆C基因病毒HBV-X15全長基因組為模板，成功構建1.2×HBV復制型質粒p1.2×HBV-EGFP，轉染HepG2細胞篩選得到穩定復制HBV的細胞系HepG2X15。HepG2X15細胞內可檢測到高水平HBsAg、HBcAg和HBV復制中間體，上清中高水平的HBsAg、HBeAg和子代HBV DNA。與HepG2.2.15細胞系相比，上清中HBsAg和HBV DNA水平更高。而且HepG2X15細胞同時穩定表達EGFP，有利于陽性篩選，并可能用于動物模型體內的示蹤顯示。

本研究中構建的HepG2X15細胞系可以支持HBV細胞內的生活周期，達到與HepG2.2.15相當水平的HBV復制和抗原表達。使用HBV自身的啟動子，更接近體外感染過程后的HBV的自然生命周期，適合用于HBV相關功能基因(組)的研究。C亞型的HBV是中國人群感染的主要基因型之一，這為進一步研究C亞型HBV的結構與功能、基因表達與調控，以及體外篩選抗HBV藥物等提供了一個很好的細胞模型。