孕期鎘暴露后子代成年卵巢顆粒細(xì)胞激素合成基因相關(guān)microRNA表達(dá)譜改變

劉張嬪，李慶宇，呂亞可，李靜雯，張文昌

鎘對雌性性腺的毒性是目前研究的熱點(diǎn)之一，子宮和卵巢是其靶器官，且鎘能通過胎盤，影響子代雌孕激素的合成與分泌[1]。課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)，孕期鎘暴露致子代成年雌性大鼠孕酮含量下降[2]。而microRNA(miRNA)可參與調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞雌孕激素的合成與分泌[3]。本課題擬建立孕期鎘暴露動物模型，篩選子代中可能參與調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞雌孕激素合成與分泌相關(guān)miRNAs，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探討鎘致子代雌孕激素合成障礙的可能機(jī)制，為進(jìn)一步研究子代卵巢損害的表觀遺傳機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 氯化鎘(純度：99%，美國Sigma公司)；SPF級SD大鼠[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2012-0002]。

1.2 卵巢顆粒細(xì)胞提取 無菌條件下，迅速從大鼠背部取出雙側(cè)卵巢，置于經(jīng)37 ℃孵育、含雙抗(青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L)的DMEM-F12培養(yǎng)液中清洗，洗凈后換置新的預(yù)熱DMEM-F12培養(yǎng)液。體式顯微鏡下用25號針頭刺破卵泡，引導(dǎo)顆粒細(xì)胞流出。收集所有細(xì)胞液，用0.075 mm(200目)不銹鋼過濾網(wǎng)過濾，1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入PBS重懸細(xì)胞，按1∶1的比例將懸液加入已配好的50% Percoll分離液上，400×g離心20 min，吸取中間白色顆粒細(xì)胞層，加入PBS，1 000 r/min條件下離心5 min，洗滌2次，加入適量含雙抗的DMEM-F12+10%FBS培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL，移至培養(yǎng)皿中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，提取顆粒細(xì)胞總RNA。

1.3 獲取卵巢顆粒細(xì)胞miRNA芯片數(shù)據(jù) 大鼠孕期分別予生理鹽水、8 mg/kg氯化鎘灌胃染毒，自然分娩獲F1代；常規(guī)飼養(yǎng)至成年，與新購健康雄性大鼠交配產(chǎn)F2代。提取F1、F2代成年雌性大鼠卵巢顆粒細(xì)胞總RNA。RNA標(biāo)記及芯片雜交等具體操作由上海康成生物公司完成。從以下3個來源探索性地篩選出可能調(diào)控子代雌孕激素合成的miRNAs。

1.3.1 miRNA芯片表達(dá)譜 以差異表達(dá)倍數(shù)(fold change, FC)>2.0且P<0.05為判斷標(biāo)準(zhǔn)，挑選出差異表達(dá)的miRNAs納入備選。以FC>2.0為判斷標(biāo)準(zhǔn)，挑選出差異表達(dá)的miRNAs納入備選。

1.3.2 數(shù)據(jù)庫預(yù)測的靶miRNA 使用TargetScan、miRWalk和miRDB在線預(yù)測軟件對甾體合成急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,StAR)及類固醇生成因子1(steroidogenic factor-1,Sf-1)、細(xì)胞色素P450側(cè)鏈裂解酶(Cyp11a1)、細(xì)胞色素P450羥化酶(Cyp17a1)和細(xì)胞色素P450芳香化酶(Cyp19a1)等雌孕激素合成過程中的關(guān)鍵基因進(jìn)行靶miRNA預(yù)測，將SUM≥2的靶miRNAs納入備選。

1.3.3 文獻(xiàn)檢索 利用Pubmed、中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)，將與卵巢顆粒細(xì)胞合成雌孕激素相關(guān)的miRNAs納入備選。

1.4 生物信息學(xué)分析 應(yīng)用TargetScan、miRWalk和miRDB在線預(yù)測軟件預(yù)測篩選的miRNAs的可能靶基因，取三者交集，應(yīng)用在線數(shù)據(jù)庫DAVID系統(tǒng)(http://david.ncifcrf.gov/)將獲得的靶向基因進(jìn)行GO(Gene ontology)及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes)pathways富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 卵巢顆粒細(xì)胞miRNA芯片分析

2.1.1 以FC>2.0作為判斷標(biāo)準(zhǔn) 使用FC>2.0作為篩選條件，篩選差異表達(dá)的miRNAs，F(xiàn)1代篩選出76個miRNAs，其中31個上調(diào)，45個下調(diào)；F2代篩選出63個miRNAs，其中22個上調(diào)，41個下調(diào)。

2.1.2 以FC>2.0且P<0.05作為判斷標(biāo)準(zhǔn) 使用FC>2.0且P<0.05作為篩選條件篩選差異表達(dá)的miRNAs，F(xiàn)1代篩選出3個miRNAs，其中 2個上調(diào)，1個下調(diào)；F2代篩選出7個miRNAs，其中6個上調(diào)，1個下調(diào)(表1、2)。

表1 F1代差異表達(dá)的microRNAs

表2 F2代差異表達(dá)的microRNAs

2.2 miRNAs篩選

2.2.1 以FC>2.0且P<0.05作為判斷標(biāo)準(zhǔn) 通過miRNA芯片差異表達(dá)分析、數(shù)據(jù)庫預(yù)測和文獻(xiàn)檢索篩選出可能調(diào)控子代雌孕激素合成的miRNAs，F(xiàn)1代挑選出2個miRNAs：rno-miR-532-3p、rno-miR-92a-2-5p；F2代挑選出4個miRNAs：rno-miR-125a-3p、rno-miR-132-3p、rno-miR-28-3p、rno-miR-125b-1-3p。

2.2.2 以FC>2.0作為判斷標(biāo)準(zhǔn) 同上，F(xiàn)1代挑選出25個可能的miRNAs：rno-miR-132-5p、rno-miR-184、rno-miR-708-5p、rno-miR-628、rno-miR-3577、rno-miR-18a-5p、rno-miR-27a-3p、rno-miR-532-5p、rno-miR-182、rno-miR-122-5p、rno-miR-532-3p、rno-miR-431、rno-miR-326-3p、rno-miR-758-5p、rno-miR-92a-2-5p、rno-miR-151-3p、rno-miR-128-3p、rno-miR-126a-5p、rno-miR-148a-3p、rno-miR-1-3p、rno-miR-187-5p、rno-miR-103-1-5p、rno-miR-27a-5p、rno-miR-96-5p、rno-miR-29b-5p；F2代挑選出20個可能的miRNAs：rno-miR-146a-5p、rno-miR-222-3p、rno-miR-883-5p、rno-miR-874-5p、rno-miR-193a-3p、rno-miR-125a-3p、rno-miR-132-3p、rno-miR-138-5p、rno-miR-143-3p、rno-miR-24-2-5p、rno-miR-28-3p、rno-miR-30d-3p、rno-miR-145-5p、rno-miR-532-3p、rno-miR-125b-1-3p、rno-miR-135b-5p、rno-miR-29a-5p、rno-miR-96-5p、rno-miR-126a-5p、rno-miR-181d-3p。

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 靶基因GO富集分析

2.3.1.1 以FC>2.0且P<0.05作為判斷標(biāo)準(zhǔn) 對F1代篩選的rno-miR-532-3p、rno-miR-92a-2-5p的靶基因進(jìn)行GO富集分析，富集到與雌孕激素相關(guān)的生物學(xué)功能為卵巢卵泡發(fā)育。對F2代篩選出的4個miRNAs進(jìn)行GO富集分析，富集到兩個相關(guān)的生物學(xué)功能：MAPK級聯(lián)和胚胎發(fā)育。

2.3.1.2 以FC>2.0作為判斷標(biāo)準(zhǔn) 分別對F1、F2代篩選出來的25、20個miRNAs的靶基因進(jìn)行GO富集分析，取排名前10的結(jié)果(圖1、2)。挑出與雌孕激素相關(guān)的富集結(jié)果，F(xiàn)1代25個miRNAs主要位于膜區(qū)域，具有類固醇激素受體活性，參與女性性腺發(fā)育、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路等生物過程。F2代20個miRNAs主要位于細(xì)胞質(zhì)區(qū)域，具有mRNA 3′-UTR結(jié)合活性，參與膽固醇生物合成過程的負(fù)調(diào)控、生殖發(fā)育過程、對雌二醇的反應(yīng)等生物學(xué)過程。

圖1 F1代microRNAs靶基因GO富集分析

2.3.2 靶基因KEGG富集分析

2.3.2.1 以FC>2.0且P<0.05作為判斷標(biāo)準(zhǔn) 對F1代篩選的2個rno-miR-532-3p和rno-miR-92a-2-5p的靶基因進(jìn)行KEGG分析，未富集到相關(guān)通路。對F2代篩選的4個miRNAs的靶基因進(jìn)行KEGG分析，富集到FOXO信號通路與雌孕激素相關(guān)。

2.3.2.2 以FC>2.0作為判斷標(biāo)準(zhǔn) 分別對F1、F2代篩選出的25、20個miRNAs的靶基因進(jìn)行KEGG分析，富集得分排名前10位如圖3、4所示。F1代富集到雌激素信號通路、Wnt 信號通路[4]、cAMP信號通路[5]、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、FOXO信號通路[6]、MAPK信號通路[7]、PI3K-Akt信號傳導(dǎo)途徑[8]等7條與雌孕激素作用相關(guān)的通路。F2代富集到與雌孕激素相關(guān)的通路有孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、MAPK信號通路和cAMP信號通路。

圖2 F2代microRNAs靶基因GO富集分析

圖3 F1代microRNAs靶基因KEGG富集分析

圖4 F2代microRNAs靶基因KEGG富集分析

3 討 論

孕期鎘暴露會影響子代卵巢顆粒細(xì)胞雌孕激素合成與分泌。課題組前期研究表明，孕期鎘暴露后F1代和F2代雌性子代卵巢顆粒細(xì)胞上清液孕酮水平降低，合成雌孕激素的關(guān)鍵基因StAR和Cyp11a1的蛋白表達(dá)水平均顯著下降[2]。但鎘引起子代雌孕激素合成與分泌障礙機(jī)制尚未清楚，而表觀遺傳學(xué)修飾被認(rèn)為起重要作用。

miRNAs是一類20～24個核苷酸單鏈非編碼RNA分子，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[9]。眾多研究表明，許多miRNAs在雌孕激素合成與分泌過程中有著重要的調(diào)控作用[3,9]。但較少研究關(guān)注鎘暴露引起的多代類固醇激素合成障礙中miRNAs是否發(fā)揮重要作用。本研究采用孕期鎘暴露后子代卵巢顆粒細(xì)胞的miRNA芯片表達(dá)譜，以FC>2.0、P<0.05為判斷標(biāo)準(zhǔn)，在F1和F2代分別獲取有3、7個顯著差異表達(dá)的miRNAs；以FC>2.0為標(biāo)準(zhǔn)篩選芯片差異表達(dá)的miRNAs，再綜合數(shù)據(jù)庫預(yù)測和文獻(xiàn)檢索進(jìn)行分析，F(xiàn)1和F2代分別篩選出25、20個可能調(diào)控子代雌孕激素合成與分泌的miRNAs，該部分結(jié)果表明與雌孕激素合成基因相關(guān)的miRNA表達(dá)譜在孕期鎘暴露的兩代子代中均發(fā)生變化。而課題組先前研究已證實(shí)，孕期鎘暴露后兩代子代合成孕酮能力顯著下降，并且發(fā)現(xiàn)在F1代和F2代中均表達(dá)上調(diào)的miR-10b-5p和miR-27a-3p，可通過靶向StAR介導(dǎo)子代卵巢顆粒細(xì)胞功能損傷[2]，說明miRNAs確實(shí)參與了子代激素合成障礙的調(diào)控。結(jié)合本研究兩代子代的GO分析均富集到與雌孕激素相關(guān)的生物學(xué)過程，其中女性性腺發(fā)育與雌孕激素密不可分[10]；類固醇激素介導(dǎo)的信號通路可能和雌孕激素的作用途徑相關(guān)；膽固醇是合成雌孕激素的原料[11]，對其生物合成過程的調(diào)控會直接影響激素的合成。KEGG分析均富集到與雌孕激素作用的相關(guān)通路。已有研究表明，重金屬鎘可通過抑制 cAMP信號通路和類固醇生成酶StAR、Cyp11a1和3βHSD的活化，顯著降低類固醇激素水平[5]，提示孕期鎘暴露后子代成年卵巢顆粒細(xì)胞中與雌孕激素相關(guān)的miRNAs會發(fā)生改變，并且可能在鎘致子代孕酮合成障礙中發(fā)揮一定作用，需引起重點(diǎn)關(guān)注。

孕期鎘暴露，F(xiàn)1代為胚胎，屬于直接暴露；F2代為F1代胚胎中原始生殖細(xì)胞，屬于間接暴露。課題組既往研究發(fā)現(xiàn)[2]，孕期鎘暴露后的F1代和F2代成年卵巢顆粒細(xì)胞激素表型變化一致，提示本模型中激素表型存在代際效應(yīng)，故以miRNAs改變?yōu)榇淼谋碛^遺傳學(xué)修飾表型是否也存在代際效應(yīng)是本次研究的關(guān)注重點(diǎn)之一。miRNAs在卵母細(xì)胞中存在為其代際效應(yīng)提供了理論基礎(chǔ)。Nilsson等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，在F0代孕期暴露于vinclozolin或DDT的F3代卵巢顆粒細(xì)胞中長鏈非編碼RNA和非編碼小RNA均存在差異表達(dá)，因其未做F1～F3代非編碼RNA的比較，故僅能提示表觀遺傳學(xué)修飾表型可能存在代際或跨代效應(yīng)。本研究以FC>2.0作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)1代和F2代分別篩選出的25、20個目標(biāo)miRNAs中存在3個共同的miRNAs，包括rno-miR-532-3p、rno-miR-126a-5p和rno-miR-96-5p，表明孕期鎘暴露后，與雌孕激素合成相關(guān)的miRNAs可能出現(xiàn)傳代效應(yīng)，可進(jìn)一步確認(rèn)其是否在F2代中差異表達(dá)。

F1和F2代的KEGG分析結(jié)果均涉及cAMP信號通路、MAPK信號通路和孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟。研究表明，在人乳腺癌細(xì)胞、人支氣管上皮細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞等細(xì)胞系中，鎘暴露可激活MAPK信號通路[13-14]，MAPK信號通路與雌孕激素相關(guān)[7]，但鎘是否會通過MAPK信號通路對卵巢顆粒細(xì)胞合成與分泌雌孕激素造成影響未知。陽良生等[15]的研究表明，孕酮誘發(fā)兩棲類卵母細(xì)胞成熟。基于以上結(jié)果，前兩條通路可能是孕期鎘暴露后兩代子代孕酮合成障礙的共同機(jī)制，需在今后進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究僅在F1代富集到雌激素信號通路、Wnt 信號通路、PI3K-Akt信號傳導(dǎo)途徑、FOXO信號通路。人腎近曲小管細(xì)胞系氯化鎘暴露可激活PI3K-Akt信號傳導(dǎo)途徑[16]。Hu等[8]的研究表明，PI3K-Akt信號傳導(dǎo)途徑參與顆粒細(xì)胞類固醇激素合成。鎘暴露誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與FOXO相關(guān)，且FOXO作為一種轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控雌孕激素合成[17]。本研究僅在F1代富集到的PI3K-Akt信號傳導(dǎo)途徑和FOXO信號通路，可能僅在F1代影響孕酮合成，并且可能是F1與F2代導(dǎo)致孕酮合成障礙的不同機(jī)制，但仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，孕期鎘暴露致子代卵巢顆粒細(xì)胞雌孕激素合成分泌障礙的機(jī)制中，相關(guān)的miRNA表達(dá)譜有發(fā)生變化，部分miRNAs出現(xiàn)代際效應(yīng)。結(jié)合課題組以往的研究結(jié)果及本研究的生信分析，提示miRNAs可能在兩代子代孕酮合成障礙中起重要的調(diào)控作用；cAMP信號通路和MAPK信號通路可能是兩代孕酮合成受損的共同機(jī)制，而PI3K-Akt信號傳導(dǎo)途徑和FOXO信號通路可能是F1代孕酮水平下降比F2代更為顯著的原因。