鎘的卵巢表觀遺傳毒理學研究進展

楊勁松(綜述)，張文昌(審校)

環境污染導致的疾病負擔已成為全球的健康挑戰[1]。鎘(cadmium, Cd)是一種毒性重金屬，被工業化國家歸為主要環境和職業性化學污染物[2-3]，其引發的健康危害仍是重要的公共衛生問題。在鎘的非職業性暴露中，吸煙和飲食是主要的途徑[4-5]。動物實驗和流行病學資料顯示，長期鎘暴露與多器官損傷及疾病密切相關，包括肝病、腎病、心血管疾病、腫瘤、生殖疾病等[3]。卵巢作為重要的女性生殖器官，也是鎘的主要作用靶點[6]。

近年來，表觀遺傳學成為生命科學研究的一大熱點。表觀遺傳學調控是研究基因的修飾，并在不改變DNA序列和結構修飾的情況下控制和調控基因的表達，其機制主要包括DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾和非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)。這些過程可能受到各種環境因素的影響，其失調與多種疾病有關[7-8]。本研究擬探討鎘的卵巢表觀遺傳毒理學進展。

1 鎘對DNA甲基化的影響

DNA甲基化是在DNA甲基化轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的作用下，胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤位點(Cytosine-phosphate-guanine sites, CpGs)二核苷酸5’端的胞嘧啶添加甲基后變成5’甲基胞嘧啶的過程，DNA甲基化主要依靠DNMT的催化和維持，其在調控基因的表達和細胞生長發育過程中發揮重要作用[9]，如調控胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)基因，X染色體失活、基因組印跡、細胞分化、老化等功能基因的表達。在生殖細胞和胚胎生長發育過程中，DNA甲基化模式經歷去甲基化及重新甲基化的過程，調控特異基因的活化與失活，進而保證卵子和胚胎的正常生長[10]。鎘暴露后卵巢細胞DNA甲基化異常主要表現在以下幾個方面：

1.1 鎘對基因組總甲基化的影響 基因組總甲基化水平的改變會增加基因組的不穩定性，鎘暴露能影響基因組總甲基化的水平，并與卵巢功能失調密切相關。妊娠期鎘暴露對F1代大鼠成年后顆粒細胞全基因組 DNA 啟動子區甲基化產生影響，與對照組比較，8.0 mg/kg 鎘暴露組基因組 DNA 發生低甲基化的數量高于發生高甲基化的數量，且主要發生在中、高密度啟動子區[11]。鎘可導致卵巢功能的異常，參照職業鎘暴露劑量對雌性大鼠進行亞急性染毒，會導致多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)和卵巢功能早衰[12]。流行病學調查證實，甲基化異常與PCOS關系密切。與對照組比較，PCOS組顆粒細胞表現出差異甲基化水平；2 977個CpGs(代表2 063個基因)存在低甲基化，而2 509個CpGs(1 777個基因)存在高甲基化[13]。以上研究提示，鎘可能通過參與卵泡發育重要過程的基因組甲基化水平失調引發婦女的卵巢缺陷。

1.2 鎘對DNMTs活性的影響 在哺乳動物中，有3種DNA甲基轉移酶DNMT1、DNMT3α和DNMT3β[14]，在著床期胚胎和生殖細胞分化過程中，DNMT3α和DNMT3β通過其新生型DNA甲基化活性建立DNA甲基化模式。一旦模式建立，維持型DNA甲基轉移酶DNMT1就會通過復制將其忠實地傳遞到下一代[15]。鎘暴露可致DNMTs酶類表達異常，進而引起DNA甲基化模式的改變。卵巢體外染鎘實驗結果顯示，隨著染鎘劑量的增加(0～10 μmol/L)，卵巢細胞DNMT1、DNMT3α和DNMT3β的mRNA表達量呈遞增趨勢，表明較低濃度的鎘能夠促進DNMTs的轉錄，從而改變DNA甲基化狀態[16]。

1.3 鎘對基因啟動子及基因表達的影響 鎘暴露會誘導特定基因啟動子DNA甲基化水平的變化，進而調節基因表達。斷乳至性成熟大鼠鎘暴露干擾了卵泡發育相關基因Figlα、H1foo、AMH及甾體激素合成相關基因StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1和CYP19A1的mRNA與蛋白表達水平；Figlα基因啟動子區CpG島甲基化在其mRNA表達下調中發揮作用；但CYP17A1和CYP19A1基因啟動子區CpG島甲基化水平未發生改變[11]，提示鎘并非通過升高上述兩種基因啟動子區CpG島的DNA甲基化水平，進而表現出其抑制mRNA表達的毒效應。進一步關注非CpG島的DNA甲基化水平也是必要的，因其也可以參與調控基因的表達[17]。鎘暴露還可導致F1代大鼠顆粒細胞Eif2s1等14個凋亡通路相關基因啟動子區發生高甲基化，Bcl-xl基因啟動子區發生低甲基化；激素合成基因Cyp1a1、Hsd17b1啟動子區發生低甲基化，DNA甲基化可能參與抑制Eif2s1基因表達的調控[18]。

由于DNA甲基化通常發生在基因改變之前，是一類早期的效應標志物，因此，對生殖細胞DNA甲基化的及早檢測有可能提示卵巢的損傷，為進一步防控生殖健康損害提供依據。

2 鎘對組蛋白修飾的影響

組蛋白不僅是一種染色質結構蛋白，而且可作為基因表達的活性調節因子參與翻譯后的化學修飾，修飾發生在組蛋白尾部的N端和C端，包括但不限于乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、類泛素化和ADP-核糖基化，這些修飾在調控基因轉錄相關過程中起著重要作用[19]。環境因素已被證明可以改變組蛋白修飾，從而改變基因轉錄的平衡[20]。鎘暴露可誘導異常的組蛋白甲基化、乙酰化，導致機體生殖功能異常[21]。急性鎘暴露后小鼠卵母細胞成熟和生育能力關鍵指標發生改變，卵母細胞發育受阻、質量下降，鎘暴露組卵母細胞蛋白賴氨酸甲基化(H3K9me3)和乙酰化(H3K9ac)整體水平低于對照組，提示組蛋白修飾等途徑可能影響卵母細胞成熟和受精能力[6]。雌鼠飲水鎘(64 mg/L)暴露后，MⅡ期卵母細胞組蛋白H3第9位賴氨酸殘基(H3K9)甲基化水平和H4第12位賴氨酸殘基(H4K12)的乙酰化水平顯著增強，說明卵母細胞的去乙酰化水平降低，影響染色體的正常分離，進而影響受精后受精卵的正常發育，表明鎘暴露可通過介導雌鼠卵母細胞組蛋白甲基化水平影響雌鼠的生殖功能[22]。

3 鎘對ncRNA的影響及調控

ncRNA是從DNA轉錄而來的功能性RNA，但未翻譯成蛋白質[23]。ncRNA按長度常分為小ncRNA(sncRNA，<200個核苷酸)和長ncRNA(lncRNA，>200個核苷酸)[24]。大量證據表明，異常的ncRNA對女性類固醇激素分泌的影響和卵巢疾病的發生密切相關[25]。ncRNA在鎘的生殖毒性作用中也發揮了重要作用。子癇前期(pre-eclampsia, PE)是一種以高血壓和蛋白尿為特征的妊娠疾病，可對母親和胎兒造成不利的健康影響。臨床資料顯示，microRNA(miRNA)失調是PE的一個重要特征，并隨著鎘暴露的增加而增強[26]。目前，有關ncRNA介導鎘的卵巢毒性機制研究主要包括以下幾個方面：

3.1 miRNA介導鎘的卵巢毒性 miRNA是一種最典型的非編碼RNA分子，包含21～22個核苷酸，根據堿基互補配對原則，miRNA與靶mRNA的3’非翻譯區結合可導致靶mRNA降解或翻譯抑制[27]。研究表明，miRNA參與了鎘所致卵巢毒性作用的多個生理病理過程，通過對目的基因的靶向效應，調控卵巢細胞凋亡、雌孕激素合成及分泌等，現已成為鎘的卵巢毒性表觀遺傳機制調控研究的重要組成部分。

3.1.1 鎘誘導miRNA的表達異常 體內和體外研究表明，鎘暴露可誘導卵巢組織和細胞miRNA表達譜發生改變。妊娠期F0代大鼠鎘暴露(8.0 mg/kg)后，取F1代成年大鼠卵巢顆粒細胞進行微陣列分析，共發現232個miRNA表達失調，111個表達量升高(fold change，FC≥1.5)，121個降低(FC≤0.67)[28]。顆粒細胞暴露于含10 μmol/L CdCl2的培養液4 h后，與對照組比較，335個miRNA表達失調(FC≥2)，191個表達量升高，144個降低，58個FC>10倍[29]。

3.1.2 miRNA表達異常與卵巢細胞損傷 鎘暴露會導致顆粒細胞增殖與凋亡、生長發育、激素合成等相關靶基因以及信號通路調節細胞因子表達的改變，從而表現為卵巢和生殖毒性，多種miRNA參與調控這些損傷過程。

3.1.2.1 凋亡相關的miRNA Zhong等[30]探討鎘對大鼠卵巢顆粒細胞(ovarian granulosa cell, OGCs)凋亡或自噬是否通過miRNAs介導。結果顯示，鎘誘導的OGCs損傷是由線粒體凋亡而非自噬介導的，包括miR-204-5p和miR-29a-3p在內的19個凋亡相關的miRNA可能參與該過程。上調的miRNAs增加對Bcl2基因mRNA和蛋白表達的靶向抑制，促進細胞凋亡，從而在鎘誘導的大鼠OGCs毒性作用中發揮重要作用。免疫球蛋白重鏈結合蛋白(immunoglobulin heavy chain-binding protein,BIP)基因的誘導表達和PERK/eIF2α路徑的激活是內質網應激繼發細胞凋亡的關鍵，BIP的調控受到多種因素的影響。鎘可通過誘導內質網應激致卵巢顆粒細胞發生損傷。有研究探討了miRNA調控BIP的可能性，篩選出5個與BIP相關的miRNA：miR-199a-5p、miR-181a-5p、miR-495、miR-30b-3p及miR-150-5p，但經qRT-PCR檢測后發現，各劑量染鎘組5個miRNA均無明顯變化，它們可能未參與BIP基因表達的調控[31]。

3.1.2.2 生長發育相關的miRNA Kitl作為一種旁分泌因子，在卵泡早期發育過程中發揮了重要作用[32]。Wang等[29]研究miRNA對小鼠卵巢顆粒細胞Kitl pre-mRNA選擇性剪接的影響，將芯片結果與Kitl以及選擇性剪接重要因子hnRNPA1、hnRNPD、SR基因靶miRNA預測結果、文獻資料的查閱結果進行比對，取交集，最終得到29個與Kitl基因表達調控相關的miRNA，其下游靶基因可能緊密參與了細胞增殖生長分化、細胞凋亡調控、應激適應、炎癥反應等毒作用效應。抗苗勒激素(anti-mullerian hormone，AMH)由早期發育卵泡中的顆粒細胞分泌，通過自分泌和旁分泌途徑發揮作用，使得原始卵泡的募集受到抑制，參與優勢卵泡的選擇，從而調節卵泡的生長發育[33]。鎘能通過上調AMH負調控干細胞因子的表達參與大鼠卵巢細胞損傷；各染毒組miR-129-5p、miR-486、miR-503-3p及miR-871-3p表達水平降低；miR-133a-5p、miR-138-5p、miR-325-3p及miR-615表達水平上升，提示它們可能參與調控鎘暴露所致的AMH表達水平的改變[34]。

3.1.2.3 甾體激素合成相關的miRNA 莊思琪[28]將鎘暴露后F1代成年大鼠顆粒細胞激素合成基因的靶miRNA進行篩選。根據微陣列芯片表達譜、在線預測軟件以及文獻綜述，篩選出10個相關miRNA，8個miRNA經qRT-PCR確認。GO分析富集到3個與雌孕激素相關的生物過程，分別為細胞內雌孕激素受體信號通路，類固醇激素介導的信號通路和膽固醇代謝過程；Pathway富集到4個與雌孕激素作用相關的通路，分別為MAPK信號轉導通路、孕酮介導卵母細胞成熟、雌孕激素信號通路以及PI3K-Akt信號通路[28]。

3.1.3 鎘對miRNA表達調控的影響 當前研究工作主要聚焦于miRNA異常表達影響靶基因轉錄后的表達和調控，但對于miRNA本身受到的表達調控研究很少。研究發現，miR-92a家族基因在個體發育、細胞的增殖、凋亡與分化、腫瘤發生及發展中發揮著至關重要的作用[35]。宗超威[36]曾深入研究miR-92a在鎘致顆粒細胞凋亡中的調控作用及miR-92a本身可能受到的調控機制，發現miR-92a-2-5p通過靶向抗凋亡基因Bcl2，參與鎘致卵巢顆粒細胞凋亡的過程；上調的轉錄因子c-myc促進了miR-92a-2-5p的轉錄過程；雖然DNA甲基化轉移酶水平降低，但miR-92a-2-5p的DNA甲基化可能未參與其表達的調控。

3.1.4 miRNA介導鎘的卵巢毒性跨代遺傳 近年來研究發現，當親代暴露于不利環境因素時，易通過跨代遺傳引起子代生理功能紊亂[37]。miRNA不僅介導鎘所致親代卵巢顆粒細胞的損傷和功能障礙，還可在不同代際進行跨代調控，表現出不同的生物學效應。F0代大鼠妊娠期鎘暴露后，F1代成年大鼠顆粒細胞miR-16和miR-92a表達上調并靶向下調Bcl2，從而參與凋亡過程；然而，F2代成年大鼠顆粒細胞未出現明顯凋亡改變，miR-92a的下調可能發揮了抑制凋亡的作用[38]。Liu等[39]篩選出10個與孕期鎘暴露F1代成年大鼠卵巢顆粒細胞雌孕激素作用通路及合成相關的miRNA，其中miR-27a-3p和miR-10b-5p可調控孕期鎘暴露致F1代成年大鼠顆粒細胞雌孕激素的合成；鎘對于F2代的雌孕激素合成功能仍具有影響，miR-27a-3p和miR-10b-5p主要通過抑制STAR基因翻譯過程來影響雌孕激素合成功能。miRNA介導的毒性跨代遺傳和調控機制十分復雜，這種跨代遺傳的持續性和危害性尚需進一步評估。

3.2 lncRNA介導鎘的生殖毒性 lncRNA是一類長度超過200個核苷酸但缺乏蛋白編碼序列的轉錄產物[40]。研究表明，lncRNA可以在轉錄后、轉錄、翻譯和翻譯后等不同水平調控基因表達[40-41]。目前，鎘暴露后對生殖器官和細胞lncRNA表達變化的研究還十分少見。有研究證實，胎盤內lncRNA表達與胎盤鎘濃度和體質量之間的相關性，lncRNA表達失調可能是鎘生殖毒性機制的一部分[42]。鎘暴露會導致C57BL/6J小鼠睪丸和精子lncRNA的差異表達，這些失調的lncRNA可能是鎘誘導的雄性生殖毒性的潛在生物標記。基因本體和KEGG路徑分析表明，差異表達的功能lncRNA的靶標與多種生命活動密切相關，如胞質鈣運輸、大分子代謝過程、細胞分化和周期等，這些生物事件和途徑已被證實與精子的產生、活力、形態和運動有關[43]。筆者推測，lncRNA也參與了卵母和顆粒細胞生理功能的調控，有待深入研究。

4 展 望

盡管表觀遺傳學改變與環境風險因素所致健康損傷的密切相關性已得到了公認，但為了進一步掌握卵巢毒性損傷的表觀遺傳調控機制，仍需更加深入的研究。首先，在動物實驗和細胞實驗中，重金屬不同暴露劑量和時間的表觀遺傳改變不盡相同，研究結果必然會存在差異，外推到人群尚有不小的難度，有必要進行前瞻性的大隊列研究，以明確其致病作用。其次，表觀遺傳修飾在調控基因表達的同時，本身也受到多因素的調控，如鎘暴露于顆粒細胞后，上調的轉錄因子c-myc促進了miR-92a-2-5p的轉錄過程。如果能發現和證實更多調控miRNA表達的通路和機制，可為治療細胞損傷提供新的策略。最后，miRNA介導環境因素毒性的跨代遺傳是當前生殖毒理學的研究前沿,生殖細胞可能作為媒介,在代際間傳遞表觀遺傳標記以實現有害環境影響的跨代遺傳。然而，該假說涉及的調控機制十分復雜，不同miRNA在不同代際生殖細胞中的表達并不相同，推測其因不同的基因靶向作用，受到更高層次的表達調控，從而維持生殖細胞的自身穩態。未來可通過系統比較動物實驗結果和人群臨床數據，研究這些跨代遺傳的精準運行機制。