瑞馬唑侖誘導(dǎo)對(duì)膿毒癥小鼠免疫和腎上腺皮質(zhì)功能的影響

孫加曉，鄭娟娟，謝文欽

膿毒癥是一種常見的、致命的疾病，其感染部位經(jīng)常突破局部組織的限制，引起一系列生理反應(yīng)失調(diào)，可迅速導(dǎo)致多器官功能障礙。目前，膿毒癥還被定義為當(dāng)細(xì)菌、病毒或真菌感染導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)時(shí)出現(xiàn)的一系列癥狀。因血管阻力降低常導(dǎo)致低血壓(敗血癥休克)、多器官衰竭(嚴(yán)重膿毒癥)和死亡[1-2]，病死率可高達(dá)28%～47%[3]，是重癥監(jiān)護(hù)病房的主要死亡原因[4]。

膿毒癥可改變維持體內(nèi)平衡的效應(yīng)細(xì)胞壽命來影響免疫系統(tǒng)的功能[5]，通過產(chǎn)生一種持久的炎癥和抗炎狀態(tài)導(dǎo)致患者永久性的器官損傷和死亡[6]。術(shù)前麻醉藥物的使用同時(shí)影響患者的免疫功能及病情預(yù)后[7]。依托咪酯是目前臨床上常用的誘導(dǎo)藥物，起效快，持續(xù)時(shí)間短，對(duì)血流動(dòng)力學(xué)特性影響較小，對(duì)膿毒癥患者免疫功能有一定保護(hù)作用[8]。但其可抑制腎上腺皮質(zhì)功能，可能增加患者術(shù)后30 d死亡率、心血管發(fā)病率和長(zhǎng)期住院的風(fēng)險(xiǎn)[9]。因此，對(duì)于膿毒癥患者使用依托咪酯仍需慎重。瑞馬唑侖是一種新型水溶性超短效靜脈鎮(zhèn)靜劑[10]，該藥起效時(shí)間短、麻醉效果強(qiáng)且對(duì)心血管影響較小，常被用于麻醉誘導(dǎo)和狀態(tài)維持[11-12]。本研究通過比較依托咪酯和瑞馬唑侖誘導(dǎo)對(duì)膿毒癥小鼠模型的免疫功能和腎上腺皮膚功能的影響，探討適用于膿毒癥患者誘導(dǎo)的麻醉藥物。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)BALB/C小鼠64只，雄性，體質(zhì)量(20±2)g[批號(hào)：SCXK(川)2020-030，華西醫(yī)院動(dòng)物中心]，動(dòng)物批次、年齡、飼養(yǎng)環(huán)境條件控制在同一基線水平。

1.2 分組 通過隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，將小鼠分為空白對(duì)照組(N組)、膿毒癥組(S組)、瑞馬唑侖組(R組)及依托咪酯組(E組)，每組樣本量為16只。

1.3 方法 實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物自由飲水，禁食12 h。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天S組、R組和E組采用腹腔內(nèi)注射脂多糖20 mg/kg(批號(hào)：L3242，美國(guó)Sigma公司)創(chuàng)建膿毒癥動(dòng)物模型。N組注射等劑量的生理鹽水。動(dòng)物出現(xiàn)以下癥狀判定為模型建立成功：呼吸頻率加快、全身寒戰(zhàn)，抱團(tuán)取暖、拒絕飲食、活動(dòng)度下降、抓取時(shí)無力逃避，毛發(fā)失去光澤、聳立且凌亂、排出稀水樣糞便。當(dāng)出現(xiàn)癥狀時(shí)記為開始時(shí)間，開始時(shí)間30 min后尾靜脈注射藥物干預(yù)：R組給予瑞馬唑侖6 mg/kg(批號(hào):200205AK，江西恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，E組給予依托咪酯8 mg/kg(批號(hào)：H32022999，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司)(R組和E組給藥劑量為預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得膿毒癥動(dòng)物翻正反射消失的ED90)，N組和S組給予等劑量生理鹽水。每組分別于注射后1 h和8 h后各取8只小鼠，采用摘除眼球取血法采集動(dòng)物血液標(biāo)本。收集2 mL血液，4 000 r/min 離心10 min，取上清，置于-20 ℃冰箱待測(cè)。用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估自然殺傷(nature killer cell, NK)細(xì)胞、CD3+、CD4+和CD8+的百分比和CD4+/CD8+水平。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)血清白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-10、促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)和皮質(zhì)酮(cortisol，Cor)的含量，操作方法嚴(yán)格參照說明書。

2 結(jié) 果

2.1 注射后1、8 h時(shí)外周血各淋巴亞群比較 注射后1 h，4 組外周血CD3+、CD4+和CD8+3項(xiàng)指標(biāo)比較，N組最高，S組最低，R組高于E組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；4組間CD4+/CD8+、NK細(xì)胞比較，N組最高，S組最低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但R組與E組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。8 h時(shí)，4組外周血CD4+指標(biāo)比較，N組最高，S組最低，R組低于E組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；4組間CD3+、CD8+和NK細(xì)胞3項(xiàng)指標(biāo)比較，N組最高，S組最低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但R組與E組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；N組CD4+/CD8+最高，S組、R組與E組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 各組小鼠外周血淋巴亞群比較

2.2 注射后1、8 h血漿中細(xì)胞因子含量比較 與N組比較，S組血清的IL-6濃度在1、8 h時(shí)均明顯上升，而IL-10濃度明顯下降(P<0.05)；R組和E組的血清IL-6濃度在1、8 h均明顯下降(P<0.05)，而IL-10濃度均明顯上升(P<0.05)；1 h 時(shí)，R組血清IL-6濃度明顯低于E組(P<0.05)，IL-10濃度明顯高于E組(P<0.05)；8 h時(shí)，R組及E組血清IL-6、IL-10濃度比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2 各組小鼠血漿中細(xì)胞因子含量比較

2.3 注射后1、8 h時(shí)血漿中ACTH和Cor含量比較 注射后1、8 h時(shí)，各組小鼠的ACTH和Cor含量比較，N組最低，S組、R組均高于E組(P<0.05)；而S組和R組的ACTH、Cor含量比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)。

表3 各組小鼠血漿中ACTH和Cor含量比較

3 討 論

膿毒癥是一種病因復(fù)雜的全身炎癥反應(yīng)綜合征。臨床膿毒癥危重患者常見的死亡原因?yàn)榻M織灌注不夠、器官功能紊亂或嚴(yán)重低血壓等[13]。相關(guān)研究指出，機(jī)體炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)狀態(tài)是膿毒癥轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵，但膿毒癥患者輔助性T細(xì)胞全面失衡，大量T細(xì)胞凋亡和巨噬細(xì)胞功能紊亂可能加速患者病情的進(jìn)展[14]。

本研究采用小鼠膿毒癥內(nèi)毒素模型作為研究對(duì)象[15-16]。一般認(rèn)為，動(dòng)物出現(xiàn)以下癥狀判定為模型建立成功：呼吸頻率加快、全身寒戰(zhàn)，抱團(tuán)取暖、拒絕飲食、活動(dòng)度下降、抓取時(shí)無力逃避，毛發(fā)失去光澤、聳立且凌亂、排出稀水樣糞便。隨著小鼠膿毒癥模型的建立成功，與N組比較，S組、R組和E組外周血各淋巴亞群下降明顯，機(jī)體免疫功能可能出現(xiàn)異常抑制，免疫細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡。與S組比較，R組、E組外周血各淋巴亞群的百分比有較高的回升，說明兩個(gè)藥物對(duì)免疫功能有一定的保護(hù)作用。而R組、E組CD3+、CD4+和CD8+淋巴亞群的百分比在注射后1 h差別明顯，但8 h時(shí)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明瑞馬唑侖對(duì)免疫功能的保護(hù)作用在短時(shí)間內(nèi)較為突出，但時(shí)間并不持久，具體持續(xù)時(shí)間仍需進(jìn)一步研究。CD4+水平的下降可能是機(jī)體免疫功能受到抑制、免疫細(xì)胞大量凋亡的結(jié)果；而CD8+水平升高說明機(jī)體的免疫功能好轉(zhuǎn)。與S組比較，R組、E組的CD8+百分比有所提升，說明膿毒癥小鼠免疫功能有好轉(zhuǎn)的趨勢(shì)，這與戚振紅等的研究相符[17]。多器官功能障礙綜合癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素是CD4+/CD8+比值下降，代表著機(jī)體存在較強(qiáng)的免疫抑制[18]。隨著免疫研究領(lǐng)域的進(jìn)步，NK細(xì)胞被認(rèn)為是充當(dāng)復(fù)雜的免疫系統(tǒng)的監(jiān)管機(jī)構(gòu)[19]；膿毒癥中的NK細(xì)胞大量降低[20]。NK細(xì)胞的活化可以通過抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，保護(hù)機(jī)體免受肺炎的攻擊，對(duì)敗血癥結(jié)果產(chǎn)生重大影響[21]。本研究中，S組、R組和E組的NK細(xì)胞均表現(xiàn)出不同程度下降，表明免疫功能受到不同程度損傷，而R組和E組的抑制程度較小。

IL-6是細(xì)胞因子連鎖反應(yīng)的標(biāo)志，一定程度上反映了炎癥和疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系。作為一個(gè)促炎因子，IL-6可以作為判斷膿毒癥預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)[22]。IL-10是抗炎介質(zhì)，可以抑制各種炎癥因子的產(chǎn)生，其特殊生理意義在于能夠局限和防止免疫功能的過度應(yīng)答從而限制附帶損害，在免疫表達(dá)中起到保護(hù)效果[23]。本研究膿毒癥模型中，瑞馬唑侖和依托咪酯對(duì)免疫功能有保護(hù)作用，在短時(shí)間內(nèi)(1 h)瑞馬唑侖的保護(hù)效果表現(xiàn)得更為明顯。

正常狀態(tài)下，機(jī)體分泌皮質(zhì)醇由ACTH調(diào)節(jié)，而ACTH則由下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)調(diào)節(jié)，皮質(zhì)醇反過來對(duì)以上兩種激素反饋抑制[24]。目前的證據(jù)表明，膿毒癥患者較高的死亡率與腎上腺皮質(zhì)功能不全密切相關(guān)[25]。依托咪酯是臨床上較常用的靜脈麻醉藥，因其對(duì)循環(huán)系統(tǒng)無不良影響，常用于危重患者的麻醉誘導(dǎo)[26]，但其對(duì)腎上腺功能有顯著抑制作用[27]，可能增加患者術(shù)后30 d的死亡率、心血管發(fā)病率及長(zhǎng)期住院的風(fēng)險(xiǎn)[9]；也有研究顯示，依托咪酯會(huì)增加膿毒癥患者的死亡率[28]。因此，對(duì)于膿毒癥患者，仍需慎用依托咪酯。本研究中，依托咪酯也表現(xiàn)較大的腎上腺皮質(zhì)功能抑制效果；而瑞馬唑侖用于誘導(dǎo)時(shí)表現(xiàn)出與依托咪酯接近的免疫保護(hù)作用，但對(duì)腎上腺皮質(zhì)功能無顯著影響。因此，瑞馬唑侖可能更適用于危重患者麻醉誘導(dǎo)。

本研究存在一定的局限性。首先，本研究只監(jiān)測(cè)了膿毒癥小鼠1、8 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，無法得知藥物對(duì)免疫功能的持續(xù)作用時(shí)間；其次，未監(jiān)測(cè)各組小鼠的血流動(dòng)力學(xué)波動(dòng)，無法得知瑞馬唑侖是否可能造成膿毒癥小鼠的血流動(dòng)力學(xué)波動(dòng)。瑞馬唑侖是否會(huì)對(duì)危重患者的近期或遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)歸有更好的收益，仍需進(jìn)一步研究。