長鏈非編碼RNA(NR_027032、NR_047116、NR_104181)及環境因素與高血壓病的關聯研究

楊 樂，林佳冰，魏東紅,3，張廷星，林少煒，謝驍旭，吳思英

高血壓病是最常見的心血管疾病，伴有心、腦、腎等器官的功能或器質性損害，也是其他心血管疾病最常見的危險因素。世界衛生組織估計，超過50%的心血管疾病由血壓升高引起[1-3]。據統計，全球成年人口中高血壓病患者約占25%，預計2025年，全球成年高血壓病人數將高達15.6億，每年有940萬人因高血壓病死亡[4-6]。研究表明，原發性高血壓發病受到遺傳因素與環境因素的共同作用，而表觀遺傳修飾尤其是長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)則可能作為其相互作用的“橋梁”，參與高血壓病的發生發展[7]。在血管內皮細胞的lncRNA相關研究中發現，lncRNA可通過多種方式作用于內皮細胞[8]。研究表明，lncRNA 21可調控新生內皮細胞的形成[9]，而lncRNA NR_104160被確定為高血壓病的潛在生物標志物[10]。本課題組前期lncRNA芯片生物信息學分析結果提示，lncRNA NR_027032(AGAP2 antisense RNA 1, AGAP2-AS1)、NR_047116(HIF1A antisense RNA 1, HIF1A-AS1)和NR_104181與心血管疾病有關[11]。本研究擬探討lncRNAs、環境因素與高血壓病的關聯，為高血壓病的防治及表觀遺傳機制探討提供基礎。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2015年9月—2017年3月就診福州某三級甲等醫院的439例高血壓病患者作為病例組，取性別、年齡均衡可比的439例非高血壓病患者為對照組，采用PASS 11.0軟件計算樣本量。根據課題組前期結果，以OR值較小的研究因素進行計算，取α=0.05，β=0.10，P0=0.507，OR=0.542，n1=n2=300例。

1.2 方法 通過面對面訪問、查看病歷、測量血壓、體格檢查，在征得患者知情同意后，了解患者的一般人口學特征、行為情況、心理狀態。體格檢查包括體質量、身高、腰圍。

1.2.1 診斷標準 吸煙指每日吸煙≥ 1 支，時間≥6個月者[12]；被動吸煙指不抽煙的人每周至少2 d吸取其他吸煙者噴吐的煙霧15 min[13]。高血壓病的診斷參照《中國高血壓防治指南2018》[收縮壓(systolic blood pressure, SBP)≥140 mmHg(1 mmHg=133.3 Pa)和(或)舒張壓(diastolic blood pressure, DBP)≥90 mmHg]。采用SDS抑郁自評量表(self-rating depression scale, SDS)與4種性格類型探究心理因素。體質量指數(body mass index, BMI)=體質量(kg)/身高2(m2)，其中18.5～24.0為正常體質量，<18.5為消瘦，24.0≤BMI<28.0為超重，BMI≥28.0為肥胖。腰圍(waist circumference, M62)經臍部中心的水平圍長，用軟尺測量，在呼氣之末、吸氣未開始時測量。M62≥90(男性)或≥85 cm(女性)定義為腹型肥胖[14]。

1.2.2 測量方法 血壓測量前30 min內要求每位研究對象禁煙、避免飲用含有咖啡因的飲料及劇烈運動，靜坐休息5 min后測量2次坐位血壓，重復測量間隔2 min，取2次讀數的平均值記錄。

1.2.3 實驗方法 獲取健康檢查資料后，按照性別、年齡進行頻數匹配，取得研究對象知情同意后，選取62例病例組和對照組血樣進行實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)實驗，測定外周血白細胞lncRNA NR_027032(AGAP2-AS1)、NR_047116(HIF1A-AS1)和NR_104181的表達量。引物序列見表1。以GAPDH為內參照，采用 Trizol 法提取總 RNA，并進行逆轉錄，取適量通過總RNA合成的cDNA作為模板進行擴增。運用2-△△CT法計算3條lncRNA的表達量。

表1 引物序列

1.3 統計學處理 采用Epidata3.1、SPSS 25.0軟件錄入并分析數據。計數資料以n(%)表示，采用χ2檢驗；計量資料非正態分布，采用非參數檢驗。多因素篩選采用多因素Logistic回歸模型，并計算比值比(odds ratio, OR)及其95% CI。P<0.05為差別具有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況比較 病例組和對照組的性別、年齡可比，且人口學特征比較，差別無統計學意義(P>0.05，表2)。

表2 一般人口學特征

2.2 環境因素 將是否患有高血壓病(0=否，1=是)作為因變量，以年齡、性別、學歷、職業、婚姻、飲酒情況、飲茶情況、被動吸煙、清淡、腹型肥胖、抑郁程度、BMI、性格類型作為自變量，以輸入法進入多因素Logistic回歸分析，變量賦值表見表3。清淡飲食是高血壓患病的保護因素，而其危險因素包括被動吸煙、超重肥胖、腹型肥胖、A型性格、抑郁(表4)。

表3 高血壓病環境影響因素變量賦值表

表4 高血壓病環境影響因素的多因素Logistic回歸分析

2.3 lncRNA的表達情況 與對照組比較，病例組的NR_027032(AGAP2-AS1)、NR_047116(HIF1A-AS1)和NR_104181的表達量較低，差別有統計學意義(P<0.05，圖1)。

各組數據以P50(P25,P75)表示。與對照組比較，△：P<0.05；△△：P<0.001；△△△：P<0.000 1。

2.4 lncRNA與高血壓患病的關聯分析 將是否患有高血壓病(0=否，1=是)作為因變量，以年齡、性別、學歷、抑郁程度、婚姻、BMI與lncRNAs的表達量作為自變量，以輸入法進入多因素Logistic回歸分析。結果顯示，在控制其他影響因素后，NR_047116(HIF1A-AS1)及NR_104181低表達可能是患高血壓病的危險因素(表5)。

表5 高血壓病表觀遺傳因素的Logistic回歸分析

3 討 論

原發性高血壓病的病因復雜，受到生物遺傳、社會心理因素、環境因素的交互影響。本研究對高血壓病的環境影響因素分析發現：被動吸煙、腹型肥胖、抑郁、超重肥胖、A型性格可增加高血壓病的患病風險，而清淡飲食可減少高血壓病的患病風險。本研究結果與《中國高血壓健康管理規范(2019)》提示類似，高血壓病發生發展的影響因素包括心理狀態不佳、飲食不健康、超重及各型肥胖等[14]。本研究中，性情急躁、沖動人群或抑郁患者的高血壓病患病風險顯著高于心理狀態穩定的人群，提示心理因素與高血壓患病存在關聯。但既往研究證實，高血壓病患者由于長期伴有慢性病，可能出現抑郁等不良情緒，從而使得生活質量下降，對病情控制造成不利影響[15]。因此，心理因素與高血壓之間的因果關聯還需要通過隊列研究等進一步探索。本研究結果亦顯示，超重肥胖及腹型肥胖者高血壓病的患病風險高于正常體質量或消瘦人群。既往的研究表明，高脂肪分布與肥胖有關，且肥胖人群左心室內徑、面積和容積均高于健康人群，影響心臟結構與功能，這些均與高血壓病的病因密切相關[16-17]。強化人群健康宣教，提高其對高血壓病的認知，注重體質量及身型管理，改變不良生活方式及飲食習慣，仍是降低人群血壓升高風險的最有效措施。

除了環境、心理因素的影響，表觀遺傳因素在疾病產生過程中也發揮著作用[10]。本研究結果顯示，病例組外周血白細胞中lncRNA NR_027032(AGAP2-AS1)、NR_047116(HIF1A-AS1)和NR_104181表達水平較對照組低。近年來研究顯示，影響高血壓病發生發展的生理機制中包括能夠塑造染色體構象、細胞增殖、調節變構酶活性的lncRNAs[18-19]。研究顯示，細胞周期調節劑的基因表達與NR_027032呈負相關，且該條lncRNA上調能夠抑制內皮細胞增殖，影響其功能[20-21]。細胞實驗證明，NR_047116與血管內皮的發育過程相關，其下調能夠可能導致血管內皮過度增殖導致動脈粥樣硬化[22]。NR_104181可能參與內皮細胞相關的炎癥反應，從而造成血管功能紊亂[23]。本研究結果亦顯示，在控制其他影響因素后，NR_047116(HIF1A-AS1)及NR_104181低表達可能是高血壓病的危險因素，lncRNAs可能通過參與血管炎癥反應、內皮細胞功能紊亂等生理機制影響高血壓病發生發展的過程，有待進一步探索。前述與高血壓病患病有關聯的lncRNA NR_027032(AGAP2-AS1)在調整影響因素后，結果顯示無關聯，考慮原因為樣本量較少。由于樣本量原因未進行環境因素與lncRNAs交互作用的具體分析，后期應加大樣本量進一步驗證。

本研究存在一定的局限性。首先，病例與對照的樣本均來自同一醫院，可能存在入院率偏倚導致研究對象代表性不足；其次，由于僅對lncRNAs進行單次檢測，難以動態評價lncRNAs，不能進行lncRNAs與高血壓病的因果關聯推斷。后期研究中將更加注重研究對象的代表性，并進行指標動態檢測，以增加結論的可靠性。