基于MAPK信號通路Nell-1蛋白對人牙髓干細胞神經向誘導分化的作用

閆雪萍 吳杉杉 王利婷 史璐

牙髓神經是存在于牙髓組織內的神經感受器，主要發(fā)揮感覺功能，并參與調控牙髓微環(huán)境和牙本質再生，通過提高牙髓神經的再生功能，對于損傷牙齒正常功能的修復、減少牙髓治療相關并發(fā)癥有重要意義[1-2]。神經細胞本身缺乏再生能力，損傷后難以自我修復，因此如何促進神經細胞修復成為研究熱點。人牙髓干細胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)是由神經嵴發(fā)育而來、位于牙髓組織中的成體干細胞，具有與骨髓間充質干細胞相似免疫表型，可自我更新和多向分化，有較強的克隆能力，且有易獲得、培養(yǎng)條件簡單的優(yōu)點，為牙髓神經細胞的再生修復提供了新的研究途徑[3]。尼爾樣-1型分子(nel-like molecule-1，Nell-1)是一種具有高度保守性的分泌型蛋白，對于成骨細胞分化、新生骨形成等方面有正向調節(jié)作用[4]。研究[5]證實，Nell-1能與其位于成骨譜系細胞表面的受體Integrinβ1結合，啟動絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號級聯(lián)，影響細胞的粘附、增殖與分化。目前關于Nell-1促進成骨向分化的相關研究較多，在神經向分化方面的相關研究較少。本研究通過體外分離hDPSCs，研究Nell-1蛋白基于MAPK信號通路對hDPSCs神經向誘導分化的調控作用及機制，為牙髓疾病的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞取材 取材于口腔頜面外科門診18～25 歲志愿者，因正畸或阻生齒新鮮拔除健康完整恒牙，從中分離hDPSCs。研究實施前向志愿者講述牙齒用途，均知情同意,并獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器 人重組Nell-1蛋白[(R&D systems，lic.Minneapolis，MN55413，USA)；300 μg/mL Nell-1蛋白存儲液配制：50 μg Nell-1蛋白溶解于167 μL無菌PBS中，以200 μL每EP管分裝，保存于-40 ℃]；p38MAPK激酶抑制劑SB203580、E-Gel Imager凝膠成像儀(Invivogen公司,美國)；β-微管蛋白3(β-tubulin class III，β-tubulin-II)單抗、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)單抗、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)單抗、cAMP應答元件結合蛋白1(cAMP responsive element binding protein-1，cREB-1)、磷酸化(phosphorylated，p)-p38MAPK單抗(Abcam，英國)；p-cREB-1、GAPDH單抗(上海信帆生物科技有限公司)；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、辣根過氧化物酶標記標記的羊抗鼠IgG抗體(廣州健侖生物科技有限公司)；ELx 800酶標儀(BioTek公司,美國)；FACSCanto II流式細胞儀(BD公司,美國)；EVOS M7000倒置熒光顯微鏡(賽默飛世爾，美國)。

1.2 方法

1.2.1 hDPSCs的分離培養(yǎng)及鑒定 牙體清潔后劈開取出牙髓，根據(jù)參考文獻[6]，以組織塊酶消化法分離hDPSCs，加入含15%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液后置于培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁后以0.25%胰酶37 ℃消化40 min，4 ℃ 1 000 r/min離心5 min，離心半徑10 cm，棄上清，傳代培養(yǎng)，取第3代細胞以流式細胞技術鑒定細胞免疫表型。

1.2.2 hDPSCs向神經樣細胞誘導分化 第3代hDPSCs細胞以2×105個/孔密度接種于24孔板，每組5 個復孔，分為對照組、Nell-1組和Nell-1+MAPK抑制劑組，細胞貼壁達80%棄原培養(yǎng)液，加入預誘導液(MEM、20%胎牛血清、10 μg/L堿性成纖維細胞生長因子)培養(yǎng)24 h后更換神經誘導液(1 μmol/L氫化可的松、2%二甲基亞砜、200 μmol/L丁羥基茴醚、10 μmol/L forskolin、0.1 mmol/L β-巰基乙醇繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d更換神經誘導液。其中Nell-1組神經誘導液加入含100 ng/mL的Nell-1，Nell-1+MAPK抑制劑組神經誘導液加入含100 ng/mL的Nell-1與10 μmol/L SB203580。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化。

1.2.3 免疫熒光檢測hDPSCs神經元早期標志物表達 誘導分化后第12天，制作各組細胞爬片，PBS洗滌3次，4%甲醛室溫固定20 min，通透20 min，5% BSA封閉30 min，加入一抗β-tubulin-III、GFAP，F(xiàn)ITC標記的IgG二抗，封片后熒光顯微鏡下觀察并檢測熒光強度。

1.2.4 Western blot檢測p38MAPK、p-p38MAPK、cREB-1、p-cREB-1蛋白相對表達量 取各組誘導分化第12天細胞，加入RIPA裂解液，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE電泳，轉移至PVDF膜，室溫下?lián)u床封閉2 h，加入一抗、二抗，37 ℃孵育1 h，Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH灰度值比值表示蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 hDPSCs分離培養(yǎng)鑒定

hDPSCs培養(yǎng)7～10 d鏡下觀察可見牙髓細胞從組織塊邊緣爬出，圍繞組織塊向四周生長，呈放射狀。原代hDPSCs傳至第3代可見外形均勻，多數(shù)為梭形，成集落狀生長，可用于后續(xù)實驗(圖 1)。流式細胞儀檢測hDPSCs表面抗原顯示，CD34、CD45表達陰性，CD105、CD90表達陽性，陽性細胞比率分別為98.52%、99.23%，符合hDPSCs的表面抗原(圖 2)。

2.2 hDPSCs神經誘導分化細胞形態(tài)變化

hDPSCs誘導前細胞梭形為主、部分為卵圓形或多角形，體積小、輪廓清晰；誘導分化后12 d Nell-1組可見細胞形態(tài)為神經元樣生長，成網狀突起，相互鏈接，核大而圓位于細胞中央；對照組與Nell-1+MAPK抑制劑組可見細胞體積收縮，為神經球樣生長(圖 3)。

圖 2 流式細胞儀檢測hDPSCs表面抗原表達

圖 3 hDPSCs神經誘導分化前后細胞形態(tài)變化

2.3 免疫熒光檢測各組神經元早期標志物表達情況

誘導分化12 d對照組、Nell-1組、Nell-1+MAPK抑制劑組均有β-tubulin-III、GFAP陽性表達(圖 4)。對β-tubulin-III、GFAP相對熒光強度值組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；Nell-1組的β-tubulin-III、GFAP相對熒光強度值高于對照組和Nell-1+MAPK抑制劑組(P<0.05)(表 1)。

2.4 各組細胞p-p38MAPK/p38MAPK、p-cREB-1/cREB-1表達比較

Nell-1組p-p38MAPK/p38MAPK、p-cREB-1/cREB-1均高于對照組和Nell-1+MAPK抑制劑組(P<0.001)(圖 5、表 2)。

表 1 β-tubulin-III、GFAP蛋白熒光定量比較

圖 4 各組hDPSCs神經誘導分化12 d后β-tubulin-III、GFAP免疫熒光圖(×200) 圖 5 各組hDPSCs p-p38MAPK、p38MAPK、p-cREB-1、cREB-1蛋白的Western blot檢測

表 2 p-p38MAPK/p38MAPK、p-cREB-1/cREB-1表達的組間比較

3 討 論

近年來，隨著干細胞療法和組織工程學的不斷發(fā)展，利用干細胞移植促進損傷神經的修復和再生相關研究不斷涌現(xiàn)。hDPSCs因組織來源和生物學特征均與神經干細胞相似，具有來源豐富、無倫理爭議、副作用小的特點，被大量應用于口腔疾病、阿爾茲海默病、帕金森病、脊髓損傷的治療等神經損傷修復和再生研究中[7-8]。Nell-1是與人類顱縫早閉癥相關的分泌型蛋白，在顱骨和神經組織中優(yōu)先表達，被證實能誘導牙髓細胞向成牙本質細胞樣細胞及神經樣細胞分化，但關于誘導分化機制尚未明確[9]。故本研究通過探討Nell-1蛋白對hDPSCs神經向分化的調控作用及機制，以期為臨床牙髓損傷的修復提供理論指導。

本研究中酶消組織塊法培養(yǎng)hDPSCs后經鑒定培養(yǎng)成功，可用于后續(xù)實驗。hDPSCs神經樣誘導分化后12 d Nell-1組可見細胞成神經元樣；免疫熒光檢測各組均β-tubulin-III、GFAP陽性表達，且Nell-1組的β-tubulin-III、GFAP相對熒光強度值高于對照組和Nell-1+MAPK抑制劑組，說明Nell-1可定向誘導hDPSCs神經樣分化。Nell-1蛋白最早從顱縫早閉患兒顱骨中分離得到，能誘導病理性成骨的形成，是新型促成骨因子，對成骨細胞分化、礦化及骨的形成和再生有誘導作用[10]。因牙髓組織與骨組織來源于顱神經嵴細胞，二者在組織來源方面具有同源性，故被用于神經向分化的研究中[11]。β-tubulin-III具有神經元特異性，是原始神經上皮中表達最早的神經標志物之一[12]。GFAP主要分布于中樞神經系統(tǒng)的星形膠質細胞，參與細胞骨架的構成并維持其張力強度，是神經膠質細胞標記物[13]。韓琦[14]研究中，以Nell-1蛋白促進hDPSCs神經向分化，結果Nell-1干預組誘導后的hDPSCs細胞有神經表面標記物GFAP、Nestin mRNA及蛋白的表達，證實Nell-1能定向誘導hDPSCs神經向分化，與本研究觀點一致。

MAPK信號通路是介導細胞對胞外信號反應的重要通路，由一組以級聯(lián)方式活化的絲/蘇氨酸蛋白激酶組成，參與細胞因子、生長因子、激素及應激等刺激引起的各種反應及細胞的增殖、分化和凋亡等生理活動[15]。P38激酶是MAPK家族主要成員，p38MAPK信號通路能被多種刺激性信號激活，激活的p38MAPK通過磷酸化核轉錄因子、細胞骨架蛋白及酶類等參與細胞的增殖、分化及凋亡等生理活動的調節(jié)[16]。cREB-1是p38MAPK下游蛋白，p38MAPK被激活后可活化CREB等轉錄因子，調節(jié)細胞的增殖、分化等活動[17]。陳雙慶等[18]研究顯示，MAPK信號通路是介導腦源性神經營養(yǎng)因子促進誘導多能干細胞分化為神經干細胞的關鍵通路。王志華[19]研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激hDPSCs增殖定向分化能力主要與MAPK信號通路蛋白的活化有關。上述研究均說明MAPK在多能干細胞分化過程中起重要調節(jié)作用。本研究結果中Nell-1組的p-p38MAPK/p38MAPK、cREB-1/cREB-1高于對照組，說明Nell-1蛋白可能通過激活MAPK信號通路蛋白活化發(fā)揮促進hDPSCs神經向分化過程，加入MAPK抑制劑后，hDPSCs神經向分化過程被抑制，進一步證實MAPK信號通路蛋白活化促進hDPSCs的神經向分化的研究結論。

綜上所述，Nell-1蛋白可影響對hDPSCs的神經向分化，MAPK通路中p38MAPK、cREB-1蛋白磷酸化參與Nell-1調控hDPSCs的神經向分化過程，可為牙髓損傷修復機制的研究提供機制。