PinX1調控PI3K/Akt信號通路影響口腔鱗癌HSC6細胞的增殖、侵襲和凋亡

鄧璐 曾利偉 焦紀蘭 江輝

口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，居全球惡性腫瘤的第八位，具有快速增長、侵襲性強和易轉移等特性[1]；臨床上，手術、放療和化療是口腔鱗癌的主要治療手段，但患者5年生存率僅在65%左右[2]。因此，深入探討口腔鱗癌的發病機制尋找新的治療策略是有必要的。人Pin2結合蛋白X1(PIN2-interacting protein X1，PinX1)是一種端粒調控基因，定位于人8p23染色體上[3]。研究[4-6]顯示，PinX1在非小細胞肺癌、肝癌和乳腺癌等多種腫瘤中常見低表達，與腫瘤臨床病理特征和不良預后密切相關。且PinX1可影響細胞增殖、侵襲能力和凋亡水平發揮抑癌作用。口腔鱗癌組織PinX1表達降低與淋巴結轉移密切相關[7]。然而，PinX1在口腔鱗癌中的調控作用未見報道。因此，本研究通過開展體外細胞實驗，通過觀察PinX1對口腔鱗癌HSC6細胞功能的影響及調控機制以揭示PinX1在口腔鱗癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、材料和儀器

人正?？谇簧掀ぜ毎闔OEC(上海雅吉生物公司)；口腔鱗癌細胞株HSC6(上海通派生物公司)；胎牛血清、青鏈霉素混合液(大連寶生物公司)；低糖改良Eagle培養基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)、高糖培養基(roswell park memorial institute，RPMI)-1640培養基(Hyclone公司，美國)；PinX1、增殖核抗原Ki67、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein 9，MMP-9)、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、磷酸化的磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphorylation phosphatidylinositol-3-hydroxykinase,p-PI3K)、磷酸化的蛋白激酶B(protein kinase B,p-Akt)、PI3K、AKT和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(Santa Cruz公司，美國)；辣根過氧化物酶標記的二抗(北京中杉金橋公司)。脂質體2000(廣州銳博生物公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司，美國)；胰蛋白酶、蛋白提取試劑盒、細胞計數(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒、膜聯蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡檢測試劑盒(上海碧云天公司)；pcDNA3.1-PinX1重組質粒(Invitrogen公司，美國)；二氧化碳細胞培養箱(HERAcell 240i，Heraeus公司，德國)；酶標儀(iMark，Bio-Rad公司，美國)；倒置熒光顯微鏡(TE2000-E，Nikon公司，日本)；流式細胞儀(Cyto FLEX，Beckman公司，美國)；凝膠掃描系統(GelDoc-It 310，UVP公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 IHC法檢測PinX1在OSCC組織中表達 收集手術切除的OSCC組織及癌旁組織樣本各30 例，IHC方法檢測其中PinX1的表達，比較2 組樣本的表達陽性率。

1.2.2 細胞培養 在溫度為37 ℃、CO2體積分數為5%和濕度飽和的環境下使用含1%青鏈霉雙抗和10%胎牛血清的DMEM高糖培養基常規培養HOEC細胞；相同環境下采用添加有1%青鏈霉雙抗和10%胎牛血清的RPMI-1640培養基常規培養HSC6細胞。

1.2.3 實驗分組與HSC6細胞轉染 將對數生長期HSC6細胞(2×105個/孔)接種至6 孔細胞板上，置于37 ℃、5%CO2條件下常規培養。實驗分為對照組(未轉染)、空載體組(轉染pcDNA3.1空載體)、PinX1組(轉染pcDNA3.1-PinX1重組質粒)和PinX1+IGF-1組(轉染pcDNA3.1-PinX1重組質粒后，用100 ng/ml的IGF-1處理20 min)，每組設置3 個平行孔。待細胞達70%～80%匯合度時，參照脂質體2000說明書步驟根據實驗分組將pcDNA3.1-PinX1重組質粒和pcDNA3.1空載體轉染至HSC6細胞中。轉染5 h后更換培養基，再繼續培養48 h后收集各組細胞，并采用免疫印跡法檢測各組細胞中PinX1蛋白的表達水平以評價轉染效果。

1.2.4 CCK-8法檢測HSC6細胞增殖 將PinX1+IGF-1組、PinX1組、空載體組和未轉染的對照組細胞以每孔105個接種至96 孔細胞板上，每組設置3 個復孔。置于37 ℃、5%CO2條件下常規培養1～4 d。培養至所需時間后，參照CCK-8試劑盒說明書上酶標儀檢測細胞的光密度值，其中檢測波長為450 nm。重復檢測3 次。

1.2.5 Transwell小室檢測HSC6細胞侵襲 將基質膠稀釋為1 mg/ml，取60 μL濃度平鋪在Transwell小室上下室間的聚碳酸酯微孔膜(孔徑為8 μm)，室溫下自然融合。以無血清培養基調整PinX1+IGF-1組、PinX1組、空載體組、對照組細胞濃度為104個/mL。在Transwell小室上室和下室內分別加入細胞懸液200 μL/孔，含血清的RPMI-1640培養基600 μL/孔，且每組設置3 個平行孔。置于37 ℃、5%CO2條件下常規培養24 h后，取出小室，小心拭去上室內殘留的細胞，4%多聚甲醛固定聚碳酸酯微孔膜下表面附著細胞30 min，再以0.1%結晶紫染色15 min。顯微鏡下觀察并統計各組中的穿膜細胞數。實驗重復3 次。

1.2.6 流式細胞儀檢測HSC6細胞凋亡 收集PinX1+IGF-1組、PinX1組、空載體組、對照組細胞，每組設3 個平行孔。經磷酸緩沖液洗滌2 次后，參照凋亡檢測試劑盒說明書進行凋亡檢測。實驗重復3 次。

1.2.7 免疫印跡法檢測HSC6細胞中PinX1、Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白的表達 向HOEC細胞、各組HSC6細胞中加入細胞裂解液提取總蛋白。變性蛋白，取50 μg加入十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳分離。蛋白分離后，電轉至聚偏二氟乙烯膜上。先用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉2 h，再以一抗工作液(PinX1 1∶100、Ki67 1∶500、MMP-9 1∶800、Bcl-2 1∶1 000、GAPDH 1∶1 000)在4 ℃下孵育24 h，最后以二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h。加入化學發光劑，暗室顯影曝光。采用凝膠掃描系統分析待測細胞中Ki67、PinX1、MMP-9和Bcl-2蛋白表達量。實驗重復3 次。

1.3 數據分析

2 結 果

2.1 PinX1在口腔鱗癌組織和HSC6細胞中的表達及轉染效果

PinX1在口腔鱗癌組織中的表達見圖 1?？谇击[癌組織PinX1蛋白陽性表達率為13.33%，癌旁組織為83.33%(P<0.05)。免疫印跡法檢測結果顯示，人口腔鱗癌HSC6細胞中PinX1蛋白的表達水平(0.24±0.03)明顯低于人正常口腔上皮HOEC細胞(0.68±0.05)(圖 2A)；轉染后各組細胞中PinX1蛋白的表達結果顯示，與對照組相比，PinX1組細胞中PinX1蛋白的表達水平明顯升高(P<0.05)，而空載體組細胞中PinX1蛋白的表達水平無明顯改變(P>0.05)(圖 2B，表 1)。

2.2 PinX1過表達對口腔鱗癌HSC6細胞增殖的影響

空載組從1 d至4 d細胞的增殖活力與對照組直接無明顯差異(P>0.05)，但PinX1組從2 d開始細胞增殖活力較對照組明顯降低(P<0.05)(表 2)。

圖 1 PinX1在口腔鱗癌和癌旁組織中的表達 (IHC, ×200)

圖 2 PinX1蛋白在HSC6細胞中的表達

表 1 各組細胞中PinX1蛋白表達水平的比較 (相對灰度值，

表 2 PinX1過表達對HSC6細胞450 nm處光密度值的影響

2.3 PinX1過表達對口腔鱗癌HSC6細胞侵襲的影響

圖 3和表 3結果顯示，空載體組中侵襲細胞數與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，但PinX1組中侵襲細胞數較對照組明顯降低(P<0.05)。

圖 3 Transwell實驗檢測各組細胞侵襲能力

2.4 PinX1過表達對口腔鱗癌HSC6細胞凋亡的影響

圖 4和表 3結果顯示，與對照組相比，PinX1組細胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)，但空載體組與對照組比較細胞凋亡率無明顯差異(P>0.05)。

圖 4 流式細胞儀檢測PinX1過表達對HSC6細胞凋亡的影響

表 3 PinX1過表達對HSC6細胞侵襲和凋亡的影響

2.5 PinX1過表達對口腔鱗癌HSC6細胞中Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白表達的影響

圖 5和表 4結果顯示，與對照組相比，PinX1組細胞中Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白的表達水平均明顯降低(P>0.05)，但空載體組中這3 項指標無明顯改變(P>0.05)。

2.6 PinX1過表達對口腔鱗癌HSC6細胞中PI3K/Akt信號通路表達的影響

與對照組比較，PinX1組HSC6細胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達顯著降低，但空載體組中p-PI3K和p-Akt蛋白表達無顯著變化(表 5)。

圖 5 免疫印跡法檢測各組HSC6細胞中Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白的表達

表 4 PinX1過表達對HSC6細胞中Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白表達的影響

表 5 PinX1過表達對HSC6細胞中PI3K/Akt信號通路表達的影響

2.7 激活PI3K/Akt信號通路能逆轉PinX1過表達對口腔鱗癌HSC6細胞生物學行為的影響

與PinX1組比較，PinX1+IGF-1組HSC6細胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達升高(表 6)；與PinX1組比較，PinX1+IGF-1組HSC6細胞凋亡率降低，侵襲細胞數升高，從2 d開始HSC6細胞增殖活力升高，Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05)(表 7～8)。

表 6 IGF-1對HSC6細胞中PI3K/Akt信號通路激活的影響

表 7 激活PI3K/Akt信號通路逆轉PinX1過表達對HSC6細胞增殖、侵襲、凋亡的影響

表 8 激活PI3K/Akt信號通路能逆轉PinX1過表達對口腔鱗癌HSC6細胞中Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白表達的影響

3 討 論

端粒是染色體末端一種DNA蛋白質復合物，在維持基因組穩定性和調控細胞增殖、凋亡等過程中發揮著重要作用；端粒酶可維持端粒穩定性，被認為是腫瘤發生發展過程中的關鍵酶[7]。PinX1是一種端粒酶強效抑制劑，其在腫瘤中的作用逐漸引起關注，Feng等[8]發現，PinX1在基底樣乳腺癌組織中異常低表達，且與腫瘤組織學分級、侵襲性密切相關；PinX1的過度表達抑制了基底樣乳腺癌細胞增殖、遷移，促進細胞凋亡。然而Kang等[9]指出，PinX1在間變性甲狀腺癌組織和細胞中的表達水平明顯高于乳頭狀甲狀腺癌，促進甲狀腺癌的細胞增殖、遷移和分化進程，發揮著類似致癌基因的作用。PinX1在不同類型的癌癥中發揮不同的作用。本研究觀察到口腔鱗癌HSC6細胞PinX1表達水平較正?？谇簧掀OEC細胞明顯降低，而成功上調PinX1表達明顯增強HSC6細胞凋亡能力，減弱增殖、侵襲能力。這提示PinX1可通過調控癌細胞生物學功能在口腔鱗癌中發揮著重要作用。

Ki67是一種細胞增殖核蛋白，常被作為口腔鱗癌細胞增殖的標記物[10]；MMP-9是維持細胞外基質降解和重塑的動態平衡中的一種基質金屬蛋白酶，與口腔鱗癌細胞增殖和轉移密切相關[11]；在細胞凋亡研究中Bcl-2是最受重視的癌基因之一，其在口腔鱗癌細胞凋亡過程中發揮著重要的抑制作用[12]。Liu等[13]研究指出，膀胱尿路上皮癌組織中PinX1表達顯著下調，且與Ki67表達呈現負相關。趙楊等[14]發現，低表達的PinXl可能通過引起MMP-9通路激活促進黑色素瘤細胞的遷移和侵襲。申聰香等[15]指出，PinX1可通過下調Bcl-2表達提高鼻咽癌細胞對順鉑的化療敏感性。本研究進一步檢測發現，上調PinX1可降低口腔鱗癌HSC6細胞中Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白的表達，這與功能分析實驗結果相一致。提示PinX1在口腔鱗癌中發揮抑癌基因作用。

PI3K/AKT作為一種重要細胞內信號轉導通路，其已被證實在口腔鱗癌等多種類型惡性腫瘤激活，參與腫瘤轉移[16]。抑制PI3K/AKT信號通路可降低口腔鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[17]。本研究顯示，PinX1可降低p-PI3K和p-Akt的表達水平，阻斷PI3K/AKT信號通路，而使用IGF-1激活PI3K/AKT信號通路則逆轉過表達PinX1對HSC6細胞增殖、侵襲、凋亡以及其相關蛋白表達的影響。提示，PinX1通過抑制PI3K/AKT信號通路在口腔鱗癌中發揮作用。

總之，PinX1通過抑制PI3K/AKT信號通路可抑制口腔鱗癌HSC6細胞增殖和侵襲，促進細胞凋亡。該結果豐富了口腔鱗癌發生發展的分子機制，為PinX1作為口腔鱗癌治療的新靶點提供了參考依據。