二、三倍體牙鲆肌肉和腦組織實時定量PCR內參基因的篩選及鑒定

杜 娜 , 張 敏, 吳志昊 焦 爽 尤 鋒 譚訓剛

(1. 中國科學院 海洋研究所 中國科學院海洋大科學研究中心, 中國科學院 實驗海洋生物學重點實驗室 山東省實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋生物與生物技術實驗室, 山東 青島 266237; 3. 中國科學院大學, 北京 100049; 4. 青島科技大學, 山東 青島266061)

細胞決定、生長發育、分化、繁殖、細胞癌變及凋亡等生化途徑都與基因的表達模式息息相關。具有靈敏度高、動態變化范圍大、高通量且精確定量的實時定量聚合酶鏈式反應(qPCR)被應用于檢測基因表達水平變化的研究中[1], 包括相對定量和絕對定量兩種方法, 其中應用最為廣泛的是相對定量方法。但是該方法受到多種因素的影響[2-3], 其中一個重要的因素就是相對實時熒光定量方法中的內源參考基因或管家基因的選擇。由于相對定量是將目的基因表達水平與標準化內參基因相比較, 這就要求所選取內源參比基因在生物的不同生長過程及不同組織間具有盡可能小的變化。

多倍體誘導是一種產生新基因型的育種方法。當生物被誘導成多倍體時, 其基因組的數量和結構會發生變化, 并導致某些基因的表達水平發生改變[4]、轉錄水平的調控和翻譯后修飾的改變, 這些都可能引起基因過表達或基因沉默, 結果導致生物表型改變[5]。一些研究表明, 在某些三倍體魚類中, 其基因表達水平降低到二倍體的狀態, 這種現象稱為劑量補償效應[6]。除此之外, 在三倍體雜交魚種中還出現不完全顯性的效應[6,7], 即三倍體生物中等位基因的表達模式與其二倍體個體不同, 包括同一基因在二、三倍體個體間的表達差異, 以及同一個基因在不同組織之間的表達差異。在三倍體鯊魚(Squalius alburnoides)的性腺中,vasa、β-肌動蛋白基因(β-actin)、核糖體蛋白L8基因(rpl8)和3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(gapdh)的表達僅來自于一套基因組[8], 而在三倍體鯽魚(Carassius auratus)中, 由于劑量補償的影響,管家基因β-肌動蛋白的絕對表達量與二倍體相等[9]。這表明染色體加倍后, 無論是組織特異性基因還是管家基因的表達水平相比二倍體都可能發生變化。因此, 在多倍體的相關研究中需要篩選合適的內源參比基因, 才能準確檢測相關基因表達水平的變化。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是中國北方、韓國和日本沿海地區重要的海水養殖經濟魚類。不同的研究對于二、三倍體牙鲆生長性狀的優勢分析并不相同, 這種現象是否由基因補償效應等機制引起的并不明確。要探究牙鲆三倍體與二倍體之間的差異表達基因, 就必須篩選合適的參比基因來對相關基因進行標準化校正, 從而使結果更可靠。已知18S核糖體RNA(18S rRNA)被認為是表達相對穩定的基因,而且在二倍體牙鲆胚胎發育過程的不同階段表達水平相對穩定[10]。因此, 在本實驗中, 作者先測定18S rRNA的變化, 再以它為參考對其他廣泛使用的7個候選參考基因進行了定量鑒定: β-肌動蛋白基因(β-actin)、β-2-微球蛋白基因(b2m)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(gapdh)、核糖體蛋白L17基因(rpl17)、α-微管蛋白基因(α-tub)、延伸因子-1-α基因(ef1-α)、泛素結合酶基因(ubc-e)。通過分析這些基因在牙鲆二、三倍體的肌肉和腦組織中表達量及在個體和倍性之間的穩定性, 以獲得較合適的內源參比基因, 用于分析組織和器官發育相關基因在牙鲆二倍體和三倍體中表達的差異, 從而探究染色體加倍對組織和器官發育的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品采集于中國科學院海洋研究所養殖的幼魚,二倍體和三倍體牙鲆各3條, 其中二倍體牙鲆的體質量分別是95.5、101、91 g, 三倍體牙鲆的體質量分別是63.5、65.5、54 g。麻醉后采集肌肉和腦于200 μL Trizol(Invitrogen, 美國)中, 并在-80 ℃冰箱保存直至使用。

1.2 總RNA提取

按照Trizol試劑使用說明提取樣品的總RNA。提取后, 用Thermo NanoDrop 2000超微量分光光度計測定RNA濃度, 使用普通瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.3 定量PCR

按照 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Takara, 日本)試劑盒的說明書合成cDNA第一鏈, 作為定量PCR的模板。按照SYBR?Premix Ex Taq?II (Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書配置定量PCR反應體系, 使用Applied Biosystems 7300 Fast Real-Time PCR擴增儀(Life Technologies, 美國)進行。PCR反應條件采用兩步法, 程序是95 ℃變性 30 s;然后是95 ℃變性 5 s, 60 ℃退火20 s, 35個循環。所有的樣品同時重復3次, 取Ct均值。

根據ZHONG等[10]的結果, 作者對18S rRNA采用絕對定量方法進行, 先擴增18S rRNA的基因組片段(引物為18S rRNA-G-F 和 18S rRNA-G-R)(表1)。將PCR所得片段連接到Peasy-T3 載體 (全式金生物技術有限公司), 通過測序驗證獲得帶有正確片段的質粒。利用去內毒素質粒提取試劑盒(康為世紀生物科技有限公司)提取質粒。用Thermo NanoDrop 2000超微量分光光度計測量濃度, 然后按照一定的比例(5×101～5×108)稀釋作為模板進行qPCR反應。以質粒拷貝數為橫坐標, Ct值為縱坐標, 繪制標準曲線。以獲得的各個組織cDNA為模板, 進行qPCR反應, 根據標準曲線以及測得的胚胎樣品Ct值, 可計算得到樣品的18S rRNA拷貝數, 以二倍體的表達量做為基準折算出倍數。

表1 基因組克隆引物和基因實時定量PCR所用引物Tab. 1 Primers for genomic cloning and real-time quantitative PCR

續表

而對于其他β-肌動蛋白基因(β-actin)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(gapdh)、核糖體蛋白L17基因(rpl17)、α-微管蛋白基因(α-tub)、延伸因子-1-α基因(ef1-α)、β-2-微球蛋白基因(b2m)和泛素結合酶基因(ubc-e) 等7個基因(引物見表1), 則以18S rRNA為內參基因, 以相對定量PCR方法, 用2-ΔΔCt法計算其相對于18S rRNA表達量的倍數, 再根據標準曲線及各自18S rRNA的Ct值計算得到的18S rRNA拷貝數, 折算出各自的絕對拷貝數, 最后再以二倍體組織的表達量作為基準折算出倍數。

1.4 數據分析

除了絕對定量分析表達倍數的方法, 還參考ZHONG等[10]和LIVAK 等[11]的方法, 利用2-ΔCt方法進行表達倍數的計算, 這兩種分析方法的數據采用Graph Pad Prism 6.01進行作圖, 并利用t檢驗 (unpairedt-test)分析不同倍性之間基因表達的差異及單因素方差分析基因表達的穩定性(one way ANOVA);另外, 還通過NormFinder[12]方法分析基因表達穩定性, 以獲取最優的內參。

2 結果

2.1 牙鲆二倍體和三倍體肌肉和腦中18S rRNA的表達

作者對牙鲆二倍體和三倍體的肌肉和腦中的18S rRNA進行了絕對定量分析, 根據標準曲線計算了各自的表達量, 以二倍體的為標準進行了表達倍數分析(圖1), 結果發現在牙鲆二倍體和三倍體不同的組織中, 18S rRNA的表達在不同倍性之間的差異是不同的。盡管18S rRNA在牙鲆三倍體和二倍體肌肉間的差異在4倍以內, 但其有顯著性(P=0.024 7)(圖1a); 而其在牙鲆三倍體和二倍體腦間的差異沒有顯著性(P=0.055 7)。

圖1 牙鲆二倍體和三倍體肌肉、腦組織中18S rRNA的表達差異Fig. 1 The fold change of 18S rRNA in the muscle and brain of diploid and triploid olive flounder

2.2 牙鲆二倍體和三倍體肌肉和腦中內參基因Ct值的分析

Ct值是反映基因表達量的一個反應閾值, 其值越大, 說明表達量越低; 不同樣品間的數值差異越小, 樣品間的基因的表達量差異越小。作者通過對ubc-e、ef1-α、rpl17、α-tub、gapdh、b2m和β-actin的Ct值分析(圖2), 發現它們在不同倍性中的差異很小, 但從中也能發現肌肉中ubc-e和b2m的Ct偏高,在26以上; 腦中ubc-e、gapdh的Ct值在26以上。而從不同個體的Ct值還可以發現gapdh和b2m的Ct值在不同倍性的個體之間差異較大。

圖2 不同基因在牙鲆二倍體和三倍體肌肉和腦中的Ct值Fig. 2 Ct value of different genes in the muscle and brain of diploid and triploid olive flounder

2.3 肌肉和腦中其他7個基因的表達倍數

作者以18S rRNA作為參比基因, 通過相對定量對其他7個基因的表達量進行了分析, 再通過各自樣品18S rRNA的絕對表達量折算出各基因的表達量, 最后分別以二倍體肌肉和腦中的表達量作為基準, 對他們的表達量進行了倍數的折算, 結果發現僅α-tub的表達在牙鲆三倍體肌肉和二倍體肌肉之間有顯著差異(圖3)(P=0.007 2), 其他6個基因的表達沒有顯著性差異; 而所有基因的表達在牙鲆三倍體腦和二倍體腦之間并沒有顯著差異(圖4)。

圖3 絕對定量方法分析不同基因在牙鲆二倍體和三倍體肌肉中表達倍數的差異

圖4 絕對定量方法分析不同基因在牙鲆二倍體和三倍體腦中表達倍數的差異Fig. 4 The fold change of different genes in brain of diploid and triploid olive flounder using absolute quantification method

2.4 以2-ΔCt方法分析表達倍數差異

根據ZHONG等[10]在牙鲆胚胎期內參基因篩選的建議, 作者利用2-ΔCt方法對其他7個基因的表達量進行了分析[10-11], 以二倍體肌肉和腦中的表達量為基準, 對他們的表達量進行了表達倍數的折算, 結果發現α-tub的表達在牙鲆三倍體和二倍體肌肉之間(P=0.032 5)有顯著差異, 其他6個基因的表達沒有顯著性差異(圖5); 而所有基因在牙鲆三倍體和二倍體腦中的表達均沒有顯著差異(圖6)。

圖5 2-ΔCt方法分析不同基因在牙鲆二倍體和三倍體肌肉中表達倍數的差異Fig. 5 The fold change of different genes in muscle of diploid and triploid olive flounder using 2-ΔCt method

圖6 2-ΔCt方法分析不同基因在牙鲆二倍體和三倍體腦中表達倍數的差異Fig. 6 The fold change of different genes in brain of diploid and triploid olive flounder using 2-ΔCt method

2.5 牙鲆三倍體和二倍體肌肉和腦中不同基因表達穩定性的比較

作者對18S rRNA、ubc-e、ef1-α、rpl17、α-tub、gapdh、b2m和β-actin在不同個體及不同倍性的肌肉和腦中的表達進行了穩定性分析(圖7、圖8)。

利用基因拷貝數計算表達倍數后發現, 在牙鲆肌肉中這些基因表達的穩定性沒有顯著性差異(圖7a),但α-tub表達的變化幅度最小,ubc-e、ef1-α次之,rpl17、β-actin、18S rRNA較次之,gapdh、b2m表達的變化幅度最大。通過2-ΔCt值獲取基因表達倍數的分析結果顯示(圖7b), 肌肉中這些基因表達的穩定性沒有顯著性差異,α-tub表達的變化幅度最小,ubc-e、ef1-α次之,rpl17、β-actin、18S rRNA較次之,gapdh、b2m的變化幅度最大。

圖7 不同基因在牙鲆二倍體和三倍體肌肉中表達的穩定性分析Fig. 7 The stability of expression of different genes in muscle of diploid and triploid olive flounder

計算基因拷貝數進行表達倍數的分析顯示(圖8a),腦中這些基因表達的穩定性有顯著性差異, 但ef1-α、rpl17、β-actin的變化幅度最小,ubc-e、α-tub次之, 再b2m、gapdh較次之, 18S rRNA表達的變化幅度最大。通過2-ΔCt方法獲得基因表達倍數的分析表明(圖8 b);腦中這些基因表達的穩定性有顯著性差異,ef1-α、β-actin、rpl17表達的變化幅度最小,ubc-e、α-tub次之,gapdh、b2m較次之, 18S rRNA表達的變化幅度最大。

圖8 不同基因在牙鲆二倍體和三倍體腦中表達的穩定性分析Fig. 8 The stability of expression of different genes in brain of diploid and triploid olive flounder

利用NormFinder[12]對肌肉和腦中18S rRNA、ubc-e、ef1-α、rpl17、α-tub、gapdh、b2m和β-actin的穩定性進行了分析, 結果顯示肌肉中穩定性最好的是rpl17、β-actin(表2),ef1-α次之,ubc-e較次之;腦中穩定性最好的是ef1-α、rpl17,β-actin次之(表3)。

表2 肌肉中基因表達穩定性分析Tab. 2 Gene expression stability analysis in muscle

表3 腦中基因表達穩定性分析Tab. 3 Gene expression stability analysis in brain

3 討論

本研究針對牙鲆二、三倍體的肌肉和腦組織中的內參基因進行了篩選, 以期篩選到相對實時定量PCR較適宜的內參基因。

作者發現利用絕對定量方法與2-ΔCt方法分析同一內參基因差異表達時所獲結果間的差異很小。在篩選內參基因時, 使用絕對定量的優勢是真實反映了其實際表達的情況, 只有保證內參基因的表達符合其實際情況, 才能篩選到合適的內參基因, 但其分析過程比較復雜, 需要通過標準曲線等一系列過程才能獲得最終結果。盡管2-ΔCt方法來源于相對定量的2-ΔΔCt方法[11], 但獲得的結果卻與絕對定量接近,且其分析過程較絕對定量簡單, 因此在篩選內參基因時, 也許使用2-ΔCt方法代替絕對定量的方法會更簡單方便。

在肌肉中通過絕對定量分析發現, 18S rRNA和α-tub的表達在牙鲆二倍體和三倍體中有著顯著性差異, 其他基因沒有顯著性差異, 這與三倍體鯽魚中β-actin的表達量與二倍體的沒有差異是一致的[9],即出現了劑量補償效應[6]。而在2-ΔCt分析方法中發現, 只有α-tub的表達在牙鲆三倍體和二倍體的肌肉之間有顯著性差異。雖然本實驗所篩選基因的表達在不同倍性之間的差異很小, 但是穩定性分析的結果表明無論是絕對定量分析還是2-ΔCt分析,α-tub的表達在不同個體之間以及倍性之間的變化差異最小,是比較適合的內參基因,ubc-e和ef1-α次之; 而Normfinder 分析發現rpl17、β-actin是比較適合的內參基因,ef1-α為次合適內參基因。因此, 不同方法獲得的內參基因并不相同, 也許使用多個內參基因分析更能反應實際表達的變化[14],ef1-α可以作為牙鲆三倍體和二倍體肌肉中較合適的內參基因之一。

在牙鲆三倍體和二倍體的腦中, 無論是絕對定量分析還是2-ΔCt分析都沒有發現表達具有顯著性差異的基因, 因此這些基因的表達表現出劑量補償效應[6]。雖然這些基因的表達在不同倍性之間的差異很小, 但穩定性分析顯示ef1-α、rpl17、β-actin的表達在不同個體及倍性之間的穩定性最好, 是比較適合的內參基因, 且NORMFINDER[12]分析發現ef1-α、rpl17是比較適合的內參基因。因此ef1-α、rpl17是不同倍性牙鲆腦組織中比較適合的內參基因。

作者發現內參基因具有組織特異性, 這與其他相關研究結果類似。比如, ZHENG等[15]在感染病原菌的牙鲆及對照個體的內參基因篩選過程中發現內參基因具有組織特異性; 在轉基因和非轉基因斑馬魚(Danio rerio)[14]研究中也發現斑馬魚內參基因的篩選也具有組織特異性。有的研究發現內參基因亦具有物種特異性的特點, 以及多個內參基因分析更能反應實際表達的變化[14]。ZHENG等[15]在牙鲆中獲得的內參基因與相同組織下斑馬魚[14]的內參基因不同, ZHONG等[10]獲得適合牙鲆發育時期的內參基因與牛胚胎期[2]的不同, 作者獲得的適合牙鲆的內參基因與斑馬魚中同一組織的適宜內參基因也不同[14]。斑馬魚中進行多個組織的定量PCR分析時需要采用多個內參基因[14], ZHONG等[10]在篩選適合牙鲆發育時期的內參基因時也發現同時用多個內參基因才能符合整個發育時期分析的要求, ZHENG等[15]在篩選牙鲆感染病原菌的內參基因時也出現類似的趨勢。本研究中也發現不同分析方法獲得較適宜內參基因存在差異, 用多個內參進行分析是比較可靠的。因此針對不同物種和組織, 根據目的需求篩選合適的內參基因, 甚至使用多個內參基因進行分析, 才能獲得可靠、最優的研究結果。