加熱滅活對下呼吸道病毒抗原檢測結果影響的初步研究*

馮星星，陳俊伶，王艷春，賀曉麗

昆明市兒童醫院/云南省兒童重大疾病研究重點實驗室：1.檢驗科； 2.感染二科；3.云南省兒科研究所，云南昆明 650028

兒童呼吸道感染是臨床上常見的兒科疾病，其中病毒是引起嬰幼兒發生急性下呼吸道感染的最主要病原體[1]，基層醫院常用的檢測方法為直接免疫熒光法(DFA)，該方法操作簡單，在基層醫院廣泛開展[2]；但該方法在處理標本時可能具有潛在的病毒生物安全危害[3]。同時，自新型冠狀病毒肺炎疫情暴發以后，國家衛生健康委員會要求，感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后再進行抗原檢測[4]。因此找到一種簡單、有效滅活病毒的標本前處理方法，降低檢驗人員感染風險很重要。參考有關嚴重急性呼吸綜合征滅活效果的文章[5-7]，加熱是滅活病毒簡單有效的方法。因此，本研究通過對下呼吸道痰液標本分別通過未滅活和加熱滅活后行DFA檢測，比較滅活前后呼吸道病毒抗原檢測結果，探索標本加熱滅活前處理，以期尋找提高實驗室生物安全保障的方法，現初步研究報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年1月5日至4月29日昆明市兒童醫院住院部經臨床確診為急性呼吸道感染、急性喘息性支氣管炎、急性扁桃體炎、急性支氣管炎、急性肺炎和急性重癥肺炎的64例患兒，其中男41例，女23例；年齡為11 d至10歲。

1.2儀器與試劑 7項呼吸道病毒檢測試劑盒(免疫熒光法)為上海貝西生物科技有限公司的產品。檢測項目有甲型流感病毒(IFA)、乙型流感病毒(IFB)、副流感病毒1型(PIV1)、副流感病毒2型(PIV2)、副流感病毒3型(PIV3)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)，包括熒光素標記的單克隆抗體7種(RSV、ADV、IFA、IFB、PIV1、PIV2、PIV3)，濃縮洗滌磷酸鹽緩沖液(40×),封閉液，抗原對照玻片，另外需配備冷丙酮。所用儀器為奧林巴斯BX65熒光顯微鏡和可調控溫度水浴箱。

1.3標本采集 患兒入院后由專業護士用一次性吸痰管抽吸痰液1.0～2.0 mL置于無菌培養管中，不得傾斜或顛覆，標本采集后2 h內送檢。

1.4操作方法

1.4.1標本處理 檢驗員按個人三級生物防護要求穿戴防護用品，在生物安全柜內將臨床采集痰液標本分成5份，一份不加熱滅活，直接用于常規7項呼吸道DFA檢測，另外4份分別于56 ℃、30 min，56 ℃、60 min，60 ℃、30 min，70 ℃、15 min在水浴箱中水浴滅活后再進行常規7項呼吸道病毒抗原DFA檢測的常規操作。

1.4.2操作步驟 未滅活和加熱滅活后的痰液標本中加入磷酸鹽緩沖液5～10 mL,在渦旋混勻器上輕微混勻,以1 500 r/min離心5 min,去除上清液留取沉淀，再用磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀1～2 次，最后將沉淀液溶解在0.5～1.0 mL磷酸鹽緩沖液中，吸管輕輕吹打使其成為細胞懸液，移液器吸取25 μL細胞懸液于玻片上點樣共7點，分別用于檢測RSV、ADV、IFA、IFB、PIV1、PIV2，PIV3。玻片空氣中室溫干燥后，冷丙酮固定10 min，取出晾干。玻片上每個細胞點加1滴相應的熒光抗體，必須完全覆蓋待測標本，將載玻片放在濕盒中置于37 ℃培養箱孵育30 min，反應時間到后，用事先配制好的磷酸鹽緩沖液浸泡洗滌。晾干后用封閉液封片，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.4.3檢測結果判斷 以200倍視野見到≥2個蘋果綠熒光細胞為陽性，否則為陰性。試劑盒提供的陰性對照/陽性對照處理同標本處理流程。合格的標本要求在放大倍數為200倍下，每個視野至少有2個上皮細胞。陰性結果為至少含有20個柱狀上皮細胞的標本中無熒光染色。如果標本中上皮細胞數量<20個則為標本不合格，應重新采樣再進行檢測。

1.5統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行數據處理與統計分析，計數資料以頻數或百分率表示，未滅活和加熱滅活方法之間的比較采用R×C或配對χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。一致性檢驗計算Kappa值，當Kappa值<0.50時一致性較差，0.50～0.75為一致性較好，>0.75時表示有極好的一致性。

2 結 果

2.1未滅活常規方法檢測標本同加熱滅活后標本結果比較 64份下呼吸道感染標本中，未滅活常規方法檢出至少一種病原體陽性39份，檢出率為60.9%(39/64)，其中RSV陽性標本檢出最多，為23份(35.9%)，其次檢出PIV3陽性11份(17.2%)，ADV陽性2份(3.1%)，PIV1 2份(3.1%)，IFA 2份(3.1%)，其中1份標本為RSV和PIV3兩種病毒混合感染。以未滅活常規DFA檢測結果為準，在未滅活常規方法呈陽性結果的39份標本中，經56 ℃、30 min,56 ℃、60 min,60 ℃、30 min,70 ℃、15 min加熱滅活后均檢測為陽性，不同溫度時間加熱滅活后的陽性符合率均為100.0%(39/39)，未滅活常規方法呈陰性結果的25份標本中，4種方法加熱滅活后均為陰性，陰性符合率為100.0%(25/25)，總符合率為100.0%(64/64)，加熱滅活同未滅活常規檢測方法一致性極好(Kappa=1.000)，且檢出結果差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2未滅活標本同加熱滅活后標本熒光顯微鏡下形態比較 DFA檢測呼吸道病毒抗原在56 ℃、30 min，56 ℃、60 min，60 ℃、30 min加熱后同未滅活常規方法比較，陽性細胞熒光狀態、陽性細胞數基本一致，沒有明顯差異，見圖1。70 ℃、15 min加熱后比較，陽性細胞數減少明顯、陽性細胞熒光強度可見明顯下降，背景無黏液絲干擾，熒光滴度明顯下降，見圖2。

注：A為未滅活，B為56 ℃、30 min，C為56 ℃、60 min，D為60 ℃、30 min。

注：A為未滅活，B為70 ℃、15 min。

3 討 論

急性呼吸道感染是導致小兒發病和死亡的一個重要原因，其中絕大多數感染由病毒引起，由于這些病毒感染的臨床表現和流行特點相似，難以用臨床癥狀和常規檢測方法進行病原鑒定區分[8]，所以對于引起呼吸道感染的病原體的早期鑒別診斷十分重要，及早干預、診斷與治療，可以降低急性呼吸道感染的發病率及病死率[9]。研究表明，采用DFA檢測7種呼吸道病毒抗原，特異度及靈敏度較高，能為小兒呼吸道病毒感染的早期診斷提供依據[10]，但是由于該方法采用的試驗標本為鼻咽拭子或下呼吸道灌洗液標本，所以在試驗處理標本過程中可能會出現生物安全危害，感染檢驗人員，所以下呼吸道標本的安全處理在實驗室生物安全防護上顯得尤為重要。新型冠狀病毒肺炎疫情暴發以來，對新型冠狀病毒的檢測也給實驗室生物安全帶來巨大風險，《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版)》指出冠狀病毒對紫外線和熱敏感[11]，因此本研究采用56 ℃、30 min，56 ℃、60 min，60 ℃、30 min，70 ℃、15 min加熱滅活前處理標本，并同未滅活常規方法檢測標本進行比較，結果表明，加熱滅活后標本陽性符合率、陰性符合率具有極好的一致性(Kappa=1.000)，兩者檢測結果差異無統計學意義(P>0.05)。

加熱是滅活病毒的簡單有效的方法，該方法不加入任何化學試劑，依靠控制溫度和時間，破壞病毒的高級結構，使其蛋白不再具有生理活性，從而失去感染、致病和繁殖能力[12]。在檢驗科實際工作中，涉及滅活標本為痰液標本的研究，更多關注的是加熱滅活對流感病毒核酸[13]、新型冠狀病毒核酸檢測[14]能力的影響，以及加熱滅活對分子生物學技術檢測結果影響的相關研究，但分子技術對實驗室條件設備、儀器、人員素質要求較高，并不適用于基層醫院開展，而對于廣大基層醫院普遍開展的DFA檢測下呼吸道病毒抗原加熱滅活的研究鮮見相關報道。檢驗科實驗室在采用DFA處理標本時，需要預防標本中存在的致病病毒可能帶來的生物安全危害[15]。目前，冠狀病毒理化特性多參考關于嚴重急性呼吸綜合征(SARS)病毒的研究，鄢心革等[5]研究指出，56 ℃下，60 min比30 min具有更好的滅活效果，30 min滅活效率為99.99%，60 min對SARS病毒滅活效率為100.00%，因此為防止滅活不徹底，筆者不推薦標本進行56 ℃、30 min加熱滅活處理。該文同時指出，滅活時間增加會導致SARS病毒抗原性降低，過長時間的滅活也會增加檢驗報告時間，因此筆者也不推薦標本56 ℃、60 min加熱滅活處理。鮑作義等[7]報道，經過70 ℃、15 min加熱滅活的標本檢測不出活SARS病毒。由于DFA檢測在結果判斷上依賴技術人員的主觀判斷，因為本研究由高職稱技師在熒光顯微鏡下進行形態比較，結果表明，陽性結果標本采用56 ℃、30 min，56 ℃、60 min，60 ℃、30 min加熱滅活后與未滅活前比較，陽性細胞熒光狀態、陽性細胞數基本一致，而采用70 ℃、15 min加熱滅活后，陽性細胞數減少明顯、陽性細胞熒光強度顯著下降，會嚴重影響DFA閱片，導致可能發出假陰性結果,原因可能為過高的溫度破壞了陽性細胞蛋白質的結構導致抗原性降低，從而影響抗原抗體反應，因此筆者不推薦為了節約檢驗時間而采用70 ℃、15 min加熱滅活方法。RABENAU等[6]指出，60 ℃處理30 min后，SARS病毒完全滅活沒有任何殘留，同時此溫度時間滅活后不影響熒光顯微鏡下觀察結果。因此筆者推薦DFA檢測采用60 ℃，30 min加熱滅活方法。本研究中筆者還發現，加熱滅活后在熒光顯微鏡下閱片，熒光背景比加熱滅活之前更加清晰干凈，有助于檢驗人員對結果進行主觀判斷，原因可能為加熱有助于痰液中的黏液絲液化，可有效避免黏液產生背景熒光對DFA結果判讀的影響。

綜上所述，加熱是滅活病毒簡單有效的方法，實驗室在進行下呼吸道病毒抗原檢測實驗時，建議對標本采用加熱滅活后再進行檢測，這樣有利于檢驗人員主觀結果判斷，同時保證檢測結果準確性，而且降低實驗室生物安全風險，有效避免實驗室工作人員發生感染。