短期增溫對青藏高原高寒草甸不同植物根際叢枝菌根真菌的影響

王譚國艷， 馬志遠， 李沛洋， 郭俊宏， 張嘉懿， 蔣勝競*

(1. 蘭州大學草地農業生態系統國家重點實驗室/蘭州大學農業農村部草牧業創新重點實驗室/蘭州大學草地農業與科技學院， 甘肅 蘭州 730020； 2. 北京大學城市與環境學院， 北京 100871)

自工業革命以來，由于化石燃料的過多使用和人類活動的增加，全球氣溫正不斷升高[1]。以全球氣溫升高為主要特征的氣候變化問題正改變著陸地生態系統的結構和功能，影響人類的生存和健康[2-3]。青藏高原作為地球上海拔最高和面積最大的高原對氣候變化尤為敏感[4]。近些年，許多研究證實了氣候變暖不僅會改變植物物候[5]及群落組成[6]，對土壤微生物的多樣性及功能同樣也具有重要影響[7-8]。然而，關于土壤微生物的重要類群之一的叢枝菌根(Arbuscular mycorrhizae，AM)真菌如何響應氣候變暖的研究相對較少。

叢枝菌根真菌隸屬于球囊菌門(Glomeromycota)，在自然界中廣泛分布，可以與陸地生態系統中80%以上的高等植物建立共生體系，形成菌根結構[9]。在菌根共生體中，AM真菌不僅能夠促進植物對礦質營養(磷素和氮素等)的吸收、增強植物抗逆抗病等生理作用[10]，還會影響植物的群落組成[11-13]。此外，菌根真菌還能夠影響土壤細菌群落結構[14],穩定土壤結構[15]，促進土壤養分循環[16]。AM真菌有重要的生理生態功能，但目前對AM真菌如何響應氣候變暖還沒有一致的結論。

AM真菌的生長只能在一定的溫度范圍內進行并且具有最適的生長溫度，因此溫度上的任何變化都會直接影響AM真菌。例如，Heinemeyer等在2004年曾發現溫度升高可以促進AM真菌根外菌絲的生長[17]。此外，因AM真菌對宿主植物或土壤環境具有一定的選擇性[18-20]，所以氣候變暖也可以通過改變植物群落結構或土壤性質從而影響AM真菌[21-22]。近些年，學者在青藏高原針對AM真菌對氣候變暖的響應做了大量研究[23-26]。如Jiang等[24]和Wei等[26]發現，AM真菌的多樣性及群落結構并不受溫度升高的顯著影響，而Shi等卻發現模擬增溫降低了AM真菌的多樣性，但對AM真菌的群落組成沒有顯著影響[25]，這一結果與Yang等在2013年的研究結果相反，他們發現模擬增溫雖然對AM真菌的多樣性沒有顯著影響，卻顯著影響了AM真菌的群落組成[23]。作為專性共生菌，AM真菌的群落組成與植物群落特征密切相關，不同的植物群落組成可能影響了AM真菌對模擬增溫的響應。因此，在植物物種水平上探究AM真菌對模擬增溫的響應，繼而得出普遍性規律對AM真菌的研究至關重要。

近些年由于高通量測序技術的快速發展，對AM真菌的研究大多集中于土壤或根系的分子學研究，對以AM真菌孢子形態鑒定為主的報道相應減少。然而，AM真菌孢子作為重要的繁殖體，無論在AM真菌種群生長或是群落構建中都具有重要作用。此外，形態鑒定的方法較分子鑒定方法具有更好的直觀性，這一方法避免了因核酸提取及PCR反應等實驗所帶來的誤差，因此對探究氣候變暖對AM真菌孢子的影響仍具有重要意義。本試驗借助野外模擬增溫平臺，以盆栽的單物種植物為研究對象，通過探究模擬增溫對不同植物根際土壤AM孢子組成的影響，旨在探討不同植物根系AM真菌孢子的分布模式及差異以及在植物物種水平上AM真菌如何響應模擬增溫。

1 材料與方法

1.1 研究地點概況

本項目在中國科學院海北高寒草甸生態系統定位研究站(北緯37°37′，東經101°19′，海拔3 200 m)進行。該研究站地處青藏高原東北隅祁連山區門源縣境內。該地氣候類型屬于高原大陸性氣候，具有典型的高原寒溫濕潤性氣候特征。海北站所在地區主要的土壤類型包括高山草甸土、高山灌叢草甸土和沼澤土主要為草氈寒凍雛形土(高山草甸土)[27]，土壤中有機質貯量豐富，氮、磷絕大部分以有機態形式存在，礦化作用較弱[28]。該地區為典型的以嵩草屬植物為建群種的高寒嵩草草甸[29]，主要物種有矮嵩草(Kobresiahumilis)，羊茅(Festucaovina)，垂穗披堿草(Elymusnutans)等[30]。

1.2 試驗設計

本研究于2016年7月份原位選取高寒草甸常見的15種植物(表1)幼苗進行室外移栽試驗，每盆4株幼苗，所選植株幼苗長勢相近且無明顯的病蟲害?；ㄅ柚睆綖?0 cm，埋入地下深度為60 cm，培養基質采用原位土與沙子按2∶1比例混合。本試驗采取的增溫方式為紅外燈管(220 V，長1 m，寬2.2 cm)加熱，燈管距地面距離1.2 m，增溫幅度約為2℃；對照組僅設置同等規格的燈罩。每個處理設置6個重復，共計180個樣品。

表1 本研究所選取的植物物種

1.3 樣品采集

經過連續兩年的增溫試驗后，于2018年8月底進行破壞性采樣，采集花盆內的根際土壤樣品，自然風干后進行AM真菌孢子的分離、計數與鑒定。AM真菌孢子的分離采用濕篩傾析-蔗糖離心法[31]并稍作修改，具體操作如下：稱取25 g風干土壤于1 L的鋼制燒杯中，加入1 000 mL的自來水，用玻璃棒快速攪拌，使得底部的土壤全部懸浮。靜置3分鐘后再次攪拌，如此反復3～4次，使得土壤的團聚體結構破碎，孢子全部釋放到水中。最后攪拌使土壤顆粒懸浮后靜置約7秒后將渾濁液迅速傾倒至兩層篩網(上層孔徑為200 μm，下層孔徑為38 μm)過濾，將下層網篩上的過濾物轉移到100 mL離心管中，3 000 r·min-1離心3 min后棄上清，加入50%(m/v)蔗糖溶液充分震蕩后3 000 r·min-1離心7 s，此時AM孢子懸浮于蔗糖溶液層，而絕大部分泥沙沉在底部。將上層蔗糖溶液倒入孔徑38 μm篩網的一側，用自來水小心沖洗后將篩子上的孢子泥沙混合物快速的抽到濾紙上(直徑7 cm)，轉移到培養皿中，體視鏡下用鑷子小心將孢子挑取到一張新的做好標記的濾紙上。分離出的孢子樣品放在4℃冰箱中(保持濕潤)保存用于后續的試驗。

1.4 AM真菌孢子的形態鑒定

將分離好的孢子取出，在體視鏡下通過觀察其顏色、大小、形狀、有無連孢菌絲等特征將所有孢子做初步的聚類、拍照、計數。取載玻片，滴一滴Melzer-PVLG染液，用鑷子將初步聚類的各組的孢子全部夾到染液中，用蓋玻片蓋上，大拇指輕輕按壓，使盡可能多的孢子破壁以保證染液充分的進入孢內，使染色充分。在染液未干之前，在體視鏡下拍照記錄。觀察孢子壁的層數、顏色、連孢菌絲的特征，通過與最新的分類信息(http://www.zor.zut.edu.pl/)比較，進一步將初步聚類的孢子進行物種鑒定。

1.5 統計分析

試驗數據用Excel進行匯總整理，并用R語言進行統計分析。所有數據在分析前都進行正態性及方差齊性檢驗，對不符合整體分布的數據進行lg轉化。AM真菌孢子組成根據每個孢子類型的數量進行相應計算。采用雙因素方差分析檢驗模擬增溫與不同植物對AM真菌孢子多樣性的影響，不同處理間的顯著性差異分析使用Post Hoc Test(Tukey法)在95%置信水平上進行檢驗。基于Bray-Curtis距離，對AM真菌的孢子群落進行主成分分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA)，使用“vegan”程序包中的“adonis”函數(PERMANOVA)檢驗模擬增溫與植物物種對AM真菌孢子組成的影響。

2 結果與分析

2.1 AM真菌孢子的形態鑒定

本研究共分離獲得1 489個AM真菌孢子，按形態特征的不同可分成17種AM真菌形態種(圖1)。這17個種分別屬于8個屬，其中球囊霉屬(Glomus)6種，無梗囊霉屬(Acaulospora)2種，巨囊霉屬(Gigaspora)1種，盾巨囊霉屬(Scutellospora)3種，平囊霉屬(Pacispora)2種，內生囊霉屬(Intraspora)1種，內養囊霉屬(Entrophospira)1種和雙孢囊霉屬(Ambispora)1種。在數量方面，金黃球囊霉(Glomusaureum)的孢子數量最多(288個)，其次為Glomuscaesaris和淺窩無梗囊霉(Acaulosporalacunosa)，孢子數量分別為249個和170個。

圖1 不同植物根際AM真菌種類

2.2 模擬增溫及植物物種對AM真菌孢子的影響

模擬增溫處理后，AM真菌孢子的豐富度并沒有顯著變化(圖2)，但模擬增溫顯著降低了AM真菌孢子的密度(P<0.05)。AM真菌孢子豐富度及孢子密度在不同宿主植物物種間差異顯著(P<0.05)。如圖3所示，珠芽蓼根系AM真菌孢子的豐富度顯著高于甘肅棘豆、線葉龍膽、麻花艽和金露梅根系AM真菌的孢子豐富度(圖3)。此外，植物物種及增溫處理的交互作用對AM真菌的孢子豐富度和密度均沒有顯著影響。在所調查的15種植物中，矮嵩草(F=13.71，P=0.004)和線葉龍膽(F=12.46，P=0.005)兩個植物物種根際的AM真菌孢子密度在模擬增溫后均顯著降低(P<0.05)；但AM真菌的孢子豐富度在不同物種中都沒有顯著變化。

圖2 AM真菌孢子豐富度(a)及密度(b)在不同處理間的差異

AM真菌孢子組成的PCoA分析和PERMANOVA結果表明：增溫處理(F=1.26，R2=0.007，P=0.26)、植物物種(F=0.99，R2=0.08，P=0.52)及二者的交互作用(F=0.82，R2=0.07，P=0.90)均對AM真菌孢子組成無顯著性影響(圖4)。此外，在不同植物物種水平上，模擬增溫同樣也沒有引起AM真菌孢子組成的顯著變化。另一方面，本試驗結果發現，AM真菌的孢子組成在不同植物物種間并沒有顯著性的差異(圖5a)，但在不同植物科之間差異顯著(F=2.02，R2=0.14，P=0.001，圖5b)。

圖4 不同處理下植物根際AM真菌孢子的PCoA分析

圖5 不同宿主植物在物種(a)和科(b)水平上根際AM真菌孢子的群落組成

3 討論

本研究在植物物種水平上探究了短期增溫對根際AM真菌孢子組成的影響，研究結果將豐富我們對青藏高原AM真菌孢子多樣性及其響應全球變暖的認識。研究結果共鑒定出17種AM真菌，分屬8個屬，孢子群落與青藏高原其他的研究結果類似。Gai等分別在莎草科植物的根際土壤和3種不同類型草地的根際土壤中檢測出26[32]和23[33]種AM真菌。這些研究結果暗示了青藏高原這一環境獨特的生態系統中具有較為豐富的AM真菌多樣性。此外，我們發現美麗盾巨孢囊霉(Scutellosporacalospora)在這3個研究中均普遍存在，說明其可能是青藏高原的廣布種。

溫度升高往往可以增加植物根系的生物量[34]，促進植物分配給AM真菌更多的光合產物[35]，所以增溫一般認為會對AM真菌的生長產生促進作用。然而本研究結果表明，在青藏高原高海拔地區，短期增溫并不會增加AM真菌的孢子多樣性，甚至還會降低AM真菌的孢子密度。依托分子鑒定技術的許多報道也證明模擬增溫對植物根系內[24]或土壤中[26]的AM真菌多樣性沒有顯著性影響。Hiiesalu等在2014年指出，AM真菌的多樣性與植物的多樣性呈正相關關系[36]，而本研究采用的是單植物物種的盆栽試驗，植物物種的單一可能是AM真菌多樣性較為穩定的原因。此外，有研究表明模擬增溫并不會顯著改變青藏高原植物的根系生物量或根冠比[37-38]，因此，穩定的AM真菌多樣性也可能與植物對短期增溫的不敏感相關。另一方面，本研究發現模擬增溫會降低植物根際AM真菌的孢子數量，這與Yang等在2013年的試驗結果并不一致，其研究表明4年的模擬增溫并不會影響AM真菌的孢子密度[23]，這可能是由于植物物種組成的差異造成的，Yang等的試驗是以自然草地為研究對象，而本研究則是以單物種的盆栽為研究對象。在植物物種水平上，本研究發現只有在矮嵩草和線葉龍膽兩個物種水平上，模擬增溫才顯著降低AM真菌的孢子密度。這種植物物種間的差異或許與不同植物的生理特性相關，未來的研究需進一步探討其具體的內在機理。在AM真菌物種水平上，本研究中AM真菌孢子密度的降低主要是由盾巨孢囊霉真菌孢子的豐度降低引起。王淼焱等在之前的研究中表明，盾巨孢囊霉真菌多分布于沿海等較為濕潤的生態系統[39]，由增溫所引起的土壤含水量降低可能不利于盾巨孢囊霉真菌的生長。

AM真菌群落組成受氣候變化的影響在青藏高原生態系統中已被多次報道[23-26]。在本研究中，AM真菌群落結構并不受模擬增溫的影響。一般認為，AM真菌的群落結構受宿主植物和土壤性質共同影響，在本研究中，穩定的植物生物量一定程度上解釋了AM真菌群落結構的穩定性。另一方面，本研究發現宿主植物在科水平上對AM真菌孢子組成具有顯著影響，但在植物物種水平上沒有顯著影響。AM真菌的宿主特異性已有較多報道[18-19]，而本研究表明，植物科的信息可以更精確地預測根際AM真菌的孢子組成。這一研究結果與石國璽等人的發現相吻合，其研究發現AM真菌侵染率在親緣關系近的植物物種內并無差異，而在不同植物科之間存在顯著差異[40]。這些研究結果支持Reinhart等的已有研究成果，表明目前已知的親緣關系并不能準確地預測植物與AM真菌間的共生關系[41]，這可能與植物在科水平上的生態位分化與AM真菌的共生具有更強的相關性有關。

現有研究表明：土壤中AM真菌的孢子一直處于產生和萌發的動態過程中[42]，本研究對AM真菌的孢子采集處于植物生長季末期，雖然具有一定的代表性，但還需進一步在更多采樣時間段進行相關研究，以期能夠獲取對AM真菌響應氣候變暖的全面認識。此外，AM真菌雖然廣泛分布于土壤中，但卻具有不同的產孢能力，如無梗囊霉科和球囊霉科的AM真菌一般認為具有較強的產孢能力[43-44]。因此，以孢子形態鑒定為手段的方法未必能全面反映AM真菌對氣候變暖的響應，未來研究需結合高通量測序等分子技術展開深入研究。

4 結論

綜上所述，本研究結果表明，青藏高原不同宿主植物根際的AM真菌孢子組成在植物科水平上存在顯著差異，模擬增溫雖然對AM真菌孢子的多樣性無顯著影響，卻顯著降低了AM真菌的孢子密度，不利于特定AM真菌物種的生長。本研究結果系統分析了不同植物物種水平上AM真菌對模擬增溫的響應，暗示了植物群落組成在影響AM真菌響應氣候變暖中的重要性，為探究氣候變暖下AM真菌的空間分布格局提供了生態依據。