BALF病原學(xué)宏基因組二代測(cè)序應(yīng)用于異常肺部影像診斷

任明霞 潘蕾 李建

空軍特色醫(yī)學(xué)中心呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,北京100142

近年來,由于糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用、惡性腫瘤的放化療、骨髓移植等致使宿主免疫功能受損,導(dǎo)致了感染性肺部疾病的增多,且大多為疑難、重癥的肺部感染,早期明確病原體,及時(shí)使用敏感藥物治療,對(duì)改善預(yù)后、減少耐藥及藥物不良反應(yīng)非常重要[1]。而非感染性肺部疾病在癥狀上可有發(fā)熱、咳嗽、咳痰、咯血等呼吸道癥狀,肺部影像異常,與感染性肺部疾病較難區(qū)分,導(dǎo)致了抗生素濫用、疾病的誤診。傳統(tǒng)的病原微生物檢測(cè)方法耗時(shí)長、陽性率低,對(duì)于未知或者罕見的病原微生物,無法快速識(shí)別,且大多數(shù)病原體不可培養(yǎng),存在局限性[2-4]。宏基因組二代測(cè)序 (metagenomic nextgeneration sequencing,m NGS)是一種新的非培養(yǎng)檢測(cè)方法,其檢測(cè)速度更快,理論上能檢測(cè)所有已知病原體,包括細(xì)菌、真菌、分枝桿菌、病毒、寄生蟲等,可早期、快速、精準(zhǔn)鑒定危重及疑難感染性疾病的病原學(xué)診斷,對(duì)于排除肺部感染也有一定的作用。目前可檢測(cè)的標(biāo)本種類很多,有靜脈血、腦 脊 液、 痰 液、 支 氣 管 肺 泡 灌 洗 液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)、其他無菌體液、咽拭子、實(shí)體組織等,本研究探討該技術(shù)檢測(cè)BALF在異常肺部影像診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性研究。收集空軍特色醫(yī)學(xué)中心2018年9月至2020年11月各科住院行支氣管鏡檢查患者的病例資料,其BALF 標(biāo)本均行m NGS檢測(cè)及常規(guī)檢測(cè)病原方法的患者58例。主要住院科室:血液科30例(51.7%)、呼吸與危重癥學(xué)科26例(44.8%)、皮膚科2例(3.5%)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)住院患者;(2)年齡不限;(3)臨床資料完整;(4)發(fā)熱和/或伴有其他 (咳嗽、咳痰、咯血等)呼吸道癥狀、病因不明[1]。(5)肺部影像異常,包括斑片影、實(shí)變影、空洞影、磨玻璃影。(6)行電子支氣管鏡檢查前常規(guī)抗感染治療但效果不佳者;(7)經(jīng)監(jiān)護(hù)人或患者知情同意并簽署知情同意書。本研究經(jīng)空軍特色醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)空特(科研第2021-110-PJ01)。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn) 感染與非感染性肺部疾病均符合納入標(biāo)準(zhǔn)的(4)、(5),感染性肺部疾病診斷標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)培養(yǎng)、涂片鏡檢、免疫學(xué)方法、PCR、m NGS檢測(cè)等,明確病原學(xué),且針對(duì)性抗感染治療病情好轉(zhuǎn),影像吸收。(2)未明確病原學(xué),臨床病史及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)、輔助檢查不支持非感染性疾病,經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療后,病情好轉(zhuǎn),影像吸收。非感染性肺部疾病診斷標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)上述多種檢測(cè)方法未查到病原學(xué),經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)、輔助檢查確診自身免疫性疾病或腫瘤,或有明確的用藥史,且排除了合并感染及繼發(fā)感染(抗感染無效,經(jīng)針對(duì)病因治療,病情好轉(zhuǎn))。(2)查到病原學(xué),但結(jié)合臨床病史不考慮致病菌、或針對(duì)病原學(xué)治療無效。

1.3.1 方法 58例行電子支氣管鏡檢查的患者,行支氣管肺泡灌洗后收集BALF 標(biāo)本,并立即送空軍特色醫(yī)學(xué)中心微生物室,按常規(guī)方法進(jìn)行檢測(cè)(普通細(xì)菌及真菌培養(yǎng)、涂片抗酸染色、Grocntt六胺銀染色、吉姆薩染色、病毒核酸檢測(cè))病原微生物,同時(shí)BALF標(biāo)本外送基因測(cè)序公司 (金匙)行m NGS法檢測(cè)細(xì)菌、真菌、結(jié)核、病毒等。制定統(tǒng)一調(diào)查表,對(duì)58 例患者臨床及微生物、m NGS的資料進(jìn)行分析。

1.3.2 m NGS 法檢測(cè)步驟 (1)核酸提取:將BALF經(jīng)生物酶和物理方法破壁離心后,取600μl上清,并使用DNA/RNA 提取試劑盒 (1901,Genskey,天津)提取DNA/RNA,提取好的DNA/RNA 經(jīng)超聲破碎至200～300 bp 大小的片段。(2)文庫構(gòu)建和測(cè)序:使用NGS建庫試劑盒(1906,Genskey,天津)進(jìn)行DNA/RNA 末端修復(fù)、接頭連接和PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增之后的文庫,用Agilent2100 生物分析儀 (Agilent Technologies,Santa Clara,美國)對(duì)文庫及插入片段大小進(jìn)行質(zhì)控,使用熒光定量PCR 測(cè)定遺傳物濃度。構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Pooling 之后,使用ILLumina Next Seq550測(cè)序儀進(jìn)行上機(jī)測(cè)序,測(cè)序模式為SE75,測(cè)序數(shù)據(jù)量不能低于20M reads。(3)生物信息學(xué)分析:過濾掉低質(zhì)量、低復(fù)雜度以及長度<70 bp的序列,去除人的參考基因組序列,所得到的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)與微生物基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),從而對(duì)微生物進(jìn)行鑒定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,正態(tài)分布計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示,2組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù) (Q1,Q3) 表示,組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料以例數(shù) (%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)兩種檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)采用四格表診斷性試驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 感染組與非感染組臨床特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 58例患者中男41例,女17例,年齡范圍為10～74歲,平均(45.1±19.1)歲。按納入標(biāo)準(zhǔn),58例患者最終確診為感染性肺部疾病 (感染組)42例,非感染性肺部疾病 (非感染組)16 例。2組在基礎(chǔ)疾病(惡性腫瘤、糖尿病、血液疾病及骨髓移植、皮膚病、自身免疫性疾病)、發(fā)熱、呼吸道癥狀 (咳嗽、咳痰、咯血),肺部可聞及啰音、血化驗(yàn)感染指標(biāo)(血白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞百分比、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原)指標(biāo)上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,BALF 中性粒細(xì)胞百分比 (參考范圍0～2%),感染組明顯高于非感染組 (P<0.05)。見表1。

表1 感染組與非感染組臨床特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

2.2 感染組BALF 檢測(cè)結(jié)果 感染組42例患者中m NGS檢測(cè)陽性37 例 (88.1%),病原微生物構(gòu)成比:普通細(xì)菌16例(43.2%);結(jié)核分枝桿菌2例 (5.4%);真菌17 例 (46.0%);病毒2 例(5.4%),常規(guī)檢測(cè)方法檢測(cè)出陽性4 例(19.5%),與m NGS 法一致,肺炎鏈球菌1 例、肺炎克雷伯桿菌1例、銅綠假單胞菌1例、肺孢子菌1例。1例BALF 標(biāo)本m NGS檢測(cè)為新型隱球菌,BALF標(biāo)本經(jīng)常規(guī)方法檢測(cè)未檢出,但最終血培養(yǎng)證實(shí)為新型隱球菌。見表2。

表2 感染組BALF行m NGS法檢測(cè)陽性的4類病原

2.3 非感染組BALF 檢測(cè)結(jié)果 非感染組16例中BALF 行 m NGS 法 檢 測(cè) 結(jié) 果 陽 性10 例(62.5%),其檢出的病原微生物分別為:危害羅爾斯頓菌3 例、人類皰疹病毒3 例、發(fā)酵乳桿菌2例、肺炎克雷伯菌1例、放線菌1例,檢測(cè)結(jié)果陰性6例(37.5%)。常規(guī)檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果為銅綠假單胞菌(6.3%),但最終未培養(yǎng)出病原菌,檢測(cè)結(jié)果陰性15例(93.7%)。

2.4 2種方法檢測(cè)時(shí)間和病原微生物檢出率比較m NGS法內(nèi)部實(shí)驗(yàn)全流程為21 h,但需要有標(biāo)本運(yùn)輸及報(bào)告解讀時(shí)間,檢測(cè)天數(shù)一般為2 d,平均(2.00±0.01)d,常規(guī)檢測(cè)出陽性結(jié)果為3～4 d,平均(3.25±0.50)d,BALF行m NGS檢測(cè)天數(shù)少于常規(guī)檢測(cè),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.000,P=0.002)。m NGS 法病原微生物檢出率為81.0%(47/58),常規(guī)方法病原微生物檢出率為8.6% (5/58),2種方法病原微生物檢出率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=61.486,P<0.001)。

2.5 最終臨床診斷和轉(zhuǎn)歸 42例最終診斷為感染性疾病,其中普通細(xì)菌感染19例 (3例未檢出病原學(xué)),結(jié)核分枝桿菌感染3例 (1例未檢出病原學(xué)),真菌感染17例,病毒感染3例 (1例未檢出病原學(xué));16例最終診斷為非感染性疾病,其中肺部惡性腫瘤5 例、藥物性肺損傷 (圖1A、B)3例、骨髓移植后肺排異3例、自身免疫性疾病(圖1C)4例(25.0%)、白血病肺累及1例。58例患者經(jīng)針對(duì)性治療后轉(zhuǎn)歸:好轉(zhuǎn)49例(84.5%),病情加重4例(6.9%),死亡5例(8.6%),好轉(zhuǎn)率較高。

圖1 肺部CT 圖 A:診斷為藥物性肺損傷,既往銀屑病,口服阿維A 膠囊20年,就診時(shí)為咳嗽、咳痰、發(fā)熱3周。B:診斷為藥物性肺損傷,因小細(xì)胞肺癌使用度伐利尤單抗2療程,有咳嗽、咳痰,支氣管黏膜活檢陰性。C:診斷為抗合成酶抗體綜合征,既往體建,咳嗽、咳黃膿痰,無皮疹、肌無力,外院抗JO-1陰性。綜合檢查結(jié)果,化驗(yàn)皮肌炎抗體全套提示抗JO-1陽性

2.6 m NGS法與常規(guī)檢測(cè)法結(jié)果比較 m NGS法較常規(guī)檢測(cè)法檢測(cè)病原的敏感度、準(zhǔn)確度均高,且假陰性較低,是其優(yōu)勢(shì)。陰性預(yù)測(cè)值雖然不太理想,但較常規(guī)檢測(cè)法高,2種方法檢測(cè)病原的陽性預(yù)測(cè)值差別不大,m NGS 法較常規(guī)檢測(cè)法檢測(cè)病原的特異度偏低和假陽性略偏高是其局限性,m NGS法較常規(guī)檢測(cè)法檢測(cè)病原的陰性預(yù)測(cè)值偏高,m NGS法檢測(cè)病原陰性有一定的排除感染性疾病的診斷價(jià)值。見表3、4。

表3 最終診斷對(duì)m NGS法的評(píng)價(jià)

3 討論

異常肺部影像,包括斑片影、實(shí)變影、空洞影、磨玻璃影等,綜合臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查,有時(shí)仍難確診,且免疫功能異常的患者往往病情危重,且病原體復(fù)雜,需要臨床醫(yī)生快速給出治療方案,國外研究報(bào)道,延遲1 h的有效抗菌及支持治療可導(dǎo)致患者病死率增加5%～10%[4]。挑戰(zhàn)臨床醫(yī)生的是:異常肺部影像是不是感染? 如果是感染,致病菌是什么? 如果不是感染,又是哪種非感染性疾病?

表4 最終診斷對(duì)常規(guī)檢測(cè)法的評(píng)價(jià)

有基礎(chǔ)疾病而免疫功能低下的患者,對(duì)多種病原體感染的易感性增加[5-6],本研究結(jié)果顯示:感染組及非感染組在患有基礎(chǔ)疾病、發(fā)熱、呼吸道癥狀、肺部可聞及啰音、血感染指標(biāo)異常上比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是感染組BALF 中性粒細(xì)胞百分比較非感染組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05),且2組BALF的中性粒細(xì)胞百分比中位數(shù)均超過正常范圍,傳統(tǒng)普通的病原學(xué)培養(yǎng)周期較長(3～7 d),且并非所有的病原體都能被培養(yǎng)出,可能還會(huì)受抗菌藥物使用的影響,導(dǎo)致BALF 常規(guī)檢測(cè)結(jié)果陰性,所以感染與非感染性疾病仍不易鑒別。本研究中1例患者,BALF 的m NGS 結(jié)果為新型隱球菌,常規(guī)微生物檢測(cè)陰性,經(jīng)與微生物室溝通,血標(biāo)本培養(yǎng)時(shí)間延長,第5天報(bào)警陽性,第9天才培養(yǎng)出新型隱球菌。與m NGS 結(jié)果一致,盡管傳統(tǒng)的病原微生物培養(yǎng)陽性為診斷金標(biāo)準(zhǔn),但培養(yǎng)周期長,因此可能會(huì)延誤最佳的治療時(shí)機(jī),且會(huì)增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2-4],而m NGS檢測(cè)其優(yōu)點(diǎn)是能夠快速、客觀地、同時(shí)檢測(cè)臨床樣本中的較多病原微生物,且無需特異性擴(kuò)增[7-9]。本研究顯示m NGS檢測(cè)天數(shù)少于常規(guī)檢測(cè)(P<0.05),與文獻(xiàn)報(bào)道相符,在臨床上可以給醫(yī)生提供制定治療方案的證據(jù)及更早的治療時(shí)間。抗菌藥物的使用對(duì)m NGS檢測(cè)的結(jié)果影響不明顯[10],相對(duì)于傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù),m NGS敏感度更高[11],本研究結(jié)果顯示:58例患者BALF 中,m NGS法較常規(guī)檢測(cè)法檢測(cè)病原的敏感度、準(zhǔn)確度均高,且假陰性較低,有其明顯的優(yōu)勢(shì),且針對(duì)性治療好轉(zhuǎn)率較高,患者獲益更多。文獻(xiàn)[12]還提示針對(duì)非結(jié)核分枝桿菌時(shí),BALF的敏感性高于痰標(biāo)本。所以針對(duì)肺部CT 提示有病變的患者,建議首選m NGS檢測(cè)的標(biāo)本為BALF,不能耐受支氣管鏡檢查的患者選擇痰或血液標(biāo)本。

有報(bào)道[12]m NGS檢測(cè)組的存活率、預(yù)后好轉(zhuǎn)率顯著高于非m NGS檢測(cè)組 (P=0.005)。本研究結(jié)果提示,經(jīng)針對(duì)性治療后的好轉(zhuǎn)率84.5%、病死率僅8.6%,病死率與本身疾病進(jìn)展有關(guān)。所以能夠早期、快速、明確診斷才能為臨床提供精準(zhǔn)治療而提高患者的生存率。多項(xiàng)研究[11,13-15]發(fā)現(xiàn),不同人群中m NGS方法檢測(cè)在病原體診斷上具有重要的參考價(jià)值:(1)免疫抑制宿主的感染,病毒和細(xì)菌診斷陽性率高于傳統(tǒng)方法3倍以上。(2)重癥膿毒癥患者,其病原微生物的診斷陽性率高。(3)社區(qū)獲得性肺炎中,其敏感度顯著高于常規(guī)培養(yǎng)法和煙曲霉特異性抗體IgG 檢測(cè)。(4)肺移植受者,其病毒病原體方面補(bǔ)充了常規(guī)診斷。本研究數(shù)據(jù)顯示:感染組的BALF 的m NGS方法檢測(cè)結(jié)果陽性的病原菌,主要為細(xì)菌和真菌,其次為病毒,考慮檢測(cè)出的病原菌構(gòu)成比例與患者所患的基礎(chǔ)疾病有關(guān)。

盡管m NGS檢測(cè)方法檢出率高,但本研究中仍有臨床考慮感染性肺部疾病5例患者,其BALF檢測(cè)結(jié)果為陰性,分析陰性結(jié)果可能原因:(1)對(duì)于罕見病原體、胞內(nèi)菌等,可能因檢岀序列數(shù)少、微生物豐度低,在報(bào)告中未能列舉。所以有時(shí)追溯原始數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢是必要的。 (2)長期保存BALF,而RNA 易被相關(guān)酶降解,檢測(cè)要求條件較高,可能存在標(biāo)本收集及運(yùn)輸不符合要求的情況。臨床考慮非肺部感染4例,圖1A～C 患者均有呼吸道癥狀,肺部CT 提示:實(shí)變影、斑片及滲出影、空洞影,與感染影像不易鑒別。BALF培養(yǎng)及m NGS方法檢測(cè)均陰性,且強(qiáng)有力的廣譜抗生素治療無效,非感染的證據(jù)較充分,結(jié)合臨床資料最終明確診斷,且對(duì)因治療效果均良好。對(duì)于異常肺部影像,除外上述陰性可能原因外,BALF 的m NGS檢測(cè)陰性可有一定的排除肺部感染性疾病的價(jià)值,故m NGS方法比傳統(tǒng)方法具有更高的陰性預(yù)測(cè)值[16]。

m NGS仍存在一定局限性, (1)m NGS對(duì)結(jié)核、真菌等厚壁微生物檢出率不太理想,但隨著破壁技術(shù)的加強(qiáng),這一弱點(diǎn)將被克服。 (2)m NGS對(duì)BALF 的要求,不能是膿性、血性,人源序列背景高,會(huì)影響病原微生物的檢出率。(3)本研究結(jié)果提示m NGS法特異度低、假陽性略偏高。對(duì)于m NGS法檢出的病原體性質(zhì)分為致病性、可能致病性及非致病性[17]。在閱讀m NGS檢測(cè)的報(bào)告時(shí),要結(jié)合微生物背景、患者的臨床特征、傳統(tǒng)的病原體檢測(cè)報(bào)告和實(shí)驗(yàn)室檢查及肺部影像學(xué)等結(jié)果綜合分析[11、18]。本研究提示最終診斷為非感染性疾病的16例,但BALF 的m NGS 檢測(cè)陽性的11例(68.8%),考慮為非致病性。對(duì)于m NGS檢測(cè)的報(bào)告,不能盲目的因其陽性的結(jié)果及檢出序列數(shù)的高低即做出診斷,需由臨床醫(yī)生結(jié)合所有資料做岀判斷,才更能體現(xiàn)m NGS檢測(cè)的價(jià)值。 (4)目前使用m NGS 進(jìn)行藥敏檢測(cè)還存在一定的困難,對(duì)于檢測(cè)出有意義的病原菌不能行藥敏試驗(yàn),仍需臨床醫(yī)生針對(duì)病原菌經(jīng)驗(yàn)性制定治療方案。

綜上所述,異常肺部影像的患者,病原學(xué)診斷困難或難以鑒別感染與非感染性疾病時(shí),選擇BALF行m NGS檢測(cè),可提供快速精準(zhǔn)的診斷依據(jù),從而精準(zhǔn)治療,避免盲目使用抗生素。目前m NGS檢測(cè)仍有一定局限性,需進(jìn)一步完善,使患者獲益更多。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突