內質網核糖體結合蛋白1表達上調對肝癌細胞遷移與侵襲的影響*

熊 蘭，周曉榕，劉 丹，劉國晨

空軍軍醫大學第二附屬醫院 疼痛科 (西安 710038)

內質網是真核細胞內參與物質運輸、代謝與蛋白質合成等調控的重要場所[1]。越來越多的研究[2]表明，各種原因導致的細胞內質網應激與腫瘤的發生發展密切相關。內質網核糖體結合蛋白1(endoplasmic reticulum ribosome-binding protein 1，RRBP1)是內質網膜上參與內質網非蛋白折疊反應的重要蛋白之一，既往在結腸癌[3]、肺癌[4]、乳腺癌[5]等多種惡性腫瘤中證實了RRBP1表達的異常上調，但目前RRBP1在肝癌中的表達模式及生物學作用尚不十分清楚。本研究分別用基于TCGA公共數據庫的生物信息學分析與免疫組化實驗，分析RRBP1在肝癌尤其是轉移性肝癌中的表達變化，并進一步通過體外細胞遷移與侵襲實驗分析RRBP1在肝癌轉移中的調控作用。

1 材料和方法

1.1 材料

肝癌HLF細胞購買自日本癌癥研究資源庫(Japanese cancer research resources bank， JCRRB)細胞庫，細胞培養用加入10%血清的DMEM培養液，培養箱內溫度設定為37 ℃，CO2濃度設定為5%。RNA提取試劑盒、RNA反轉錄試劑盒、熒光定量PCR反應96孔板、PCR試劑與PCR引物均購自上海生工生物公司。Transwell小室購自美國Corning公司，基質膠購自美國BD公司，所有抗體均購自武漢三鷹生物公司。

1.2 方法

1.2.1 RRBP1表達的生物信息分析 利用基于癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)的在線腫瘤基因表達分析工具UALCAN[6]，對RRBP1在正常肝組織、未轉移肝癌組織與轉移肝癌組織中的表達進行分析。

1.2.2 免疫組化實驗 選取2012～2019年空軍軍醫大學第二附屬醫院(唐都醫院)普外科收集的36對肝癌原發灶與轉移灶組織，組織依次經4%多聚甲醛固定、石蠟包埋與切片后，進行免疫組化染色。實驗步驟為：將切片置于 67 ℃溫箱內加熱1 h，之后依次置于3個重復的二甲苯、無水乙醇、85% 乙醇、70% 乙醇與3% H2O2的玻璃缸中浸泡，檸檬酸高壓修復10 min后，用BSA封閉10 min，之后加入稀釋過的RRBP1抗體在4 ℃孵育12 h，PBS緩沖液清洗3次，隨后依次加入免疫組化試劑盒中的二抗、三抗與DAB。最后，用蘇木精對細胞核進行襯染并對切片進行脫水、透明與封片。

1.2.3 細胞轉染siRNA 將處在對數生長期的肝癌HLF細胞消化、離心并計數，隨后按2×105個/孔的密度接種至6孔板內，細胞培養8 h貼壁后進行換液，隨后用Lipofectamine 3000為轉染介質，向肝癌HLF細胞內轉染靶向RRBP1(siRRBP1)或對照(siCtrl)siRNA片段，轉染8 h后為細胞更換新鮮培養液并繼續培養24 h。siRRBP1序列為：5′-GCU CUGUAGUGAAUUCCAUTT-3′(正向)與5′-AU GGAAUUCACUACAGAGCTT-3′(反向)；siCtrl序列為：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′(正向)與5′-ACGUGACACGUUCGUAGAATT-3′(反向)。

1.2.4 RT-PCR實驗 首先，用Trizol裂解液提取不同處理組肝癌細胞的總RNA，隨后將RNA反轉錄合成cDNA，最后將反轉錄合成的cDNA進行實時熒光定量PCR。各目的基因擴增引物序列如下：RRBP1：正向：5′-TACGACACTCAAACCTTG GGG-3′；反向：5′-GTTGGCTAGGGCTTCTTCA TA-3′。E-cadherin：正向：5′-ATTTTTCCCTCG ACACCCGAT-3′；反向：5′-TCCCAGGCGTAGAC CAAGA-3′。N-cadherin：正向：5′-AGCTCCATTC CGACTTAGACA-3′;反向：5′-CAGCCTGAGCAC GAAGAGTG-3′。ZO -1：正向：5′-CGACCAGATC CTCAGGGTAA-3′；反向：5′-TCCATAGGGAGA TTCCTTCTCA-3′。Vimentin：正向：5′-GACGCC ATCAACACCGAGTT-3′；反向：5′-CTTTGTCGT TGGTTAGCTGGT-3′。內參β-actin：正向：5′-TC GCCTTTGCCGATCCG-3；反向：5′-ATGATCTG GGTCATCTTCTCG-3′。最后，用2-△△CT法計算各組細胞中目的基因的相對表達水平。

1.2.5 蛋白質印跡技術實驗 首先，將不同處理組的肝癌細胞用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液于液冰上裂解0.5 h，隨后將細胞裂解液轉移至1.5 mL的離心管中，4 ℃，離心力14 000 r/min，離心半徑13.5 cm，20 min后收集上清，加入5×loading buffer煮沸6 min，各組細胞所提的蛋白樣品經聚丙烯酰胺凝膠分離后轉印至PVDF膜上，將膜置于脫脂牛奶封閉1 h后加入稀釋過的一抗(RRBP1)，4 ℃孵育12 h后用緩沖液PBS洗膜3次，加入二抗于室溫下孵育1.5 h，PBS洗膜3次后加入DAB顯色。

1.2.6 細胞劃痕實驗 將不同處理組的肝癌細胞用胰酶消化、離心收集并計數，然后將2×105個細胞接種至6孔板內，培養12 h后待細胞鋪滿培養孔底面積約90%時，用槍頭在直尺協助下劃線，PBS洗去劃痕處未脫落細胞，隨后在顯微鏡下對劃痕進行拍照，將培養板置于培養箱中培養48 h后，再次置于顯微鏡下對劃痕進行拍照。最后，用Image J圖像分析軟件分析各組細胞劃痕愈合程度。

1.2.7 Transwell細胞遷移與侵襲實驗 將不同處理組的肝癌細胞用胰酶消化、離心收集并計數，遷移與侵襲實驗分別用不帶基質膠或帶有基質膠的Transwell小室進行。用移液器將0.2 mL濃度為2×105個/mL的細胞懸液接種至Transwell小室內，小室下部加入0.5 mL含15%胎牛血清的 DMEM 培養液，將小室置于細胞培養箱中培養24 h(遷移實驗)或48 h(侵襲實驗)后取出。用棉簽擦去上室內未發生遷移與侵襲的細胞，將遷移或侵襲至小室膜另一側的細胞用4%多聚甲醛固定10 min后，隨后加入結晶紫染色15 min，PBS清洗3次后，將小室置于通風櫥內晾干，最后在顯微鏡下拍照和計數。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 RRBP1在肝癌轉移灶中的表達

利用基于TCGA公共數據庫的UALCAN在線分析工具，對RRBP1在正常肝組織、未發生轉移的肝癌組織與發生轉移的肝癌組織中的表達進行了分析，結果顯示，RRBP1表達在正常肝組織中最低，其次為未發生轉移的肝癌組織，而在發生轉移的肝癌組織中表達最高(正常vs原位癌，P<0.001；原位癌vs轉移癌，P<0.001)，這提示RRBP1在促進肝癌發生與轉移過程中發揮了重要作用(圖 1)。

為驗證公共數據分析所得結果，用免疫組化實驗檢測了36對肝癌原發灶組織與轉移灶組織中RRBP1的表達，結果發現，RRBP1陽性染色主要集中在細胞漿中，并呈顆粒狀著色(圖2A)。與原發灶肝癌相比，RRBP1在轉移灶肝癌組織中的表達升高(t=6.324，P<0.001)(圖2B)，進一步提示RRBP1在促進肝癌轉移中發揮調控作用。

圖2 免疫組化檢測36對肝癌原發灶組織與轉移灶組織中RRBP1的表達

2.2 下調RRBP1表達對肝癌細胞運動與遷移能力的影響

RRBP1在肝癌轉移灶組織中表達高于原發灶，提示其可能在肝癌轉移過程中發揮調控作用，因此在體外肝癌細胞中通過下調RRBP1表達，用劃痕實驗、Transwell遷移與侵襲實驗分析了對肝癌細胞運動、遷移與侵襲能力的影響。

設計合成了靶向RRBP1表達的siRNA，并將其轉入肝癌HLF細胞內，隨后用RT-PCR與蛋白質印跡技術實驗對RRBP1表達干涉效率進行了分析，結果發現，轉染靶向RRBP1的siRNA 24 h后，肝癌細胞HLF中的RRBP1表達在mRNA(t=17.012，P<0.001)與蛋白水平中均明顯降低，表明所構建RRBP1表達下調肝癌模型可滿足后續細胞運動、遷移與侵襲實驗的要求(圖3)。

圖3 轉染siRNA對RRBP1表達的干涉效率鑒定

用細胞劃痕實驗分析了RRBP1在肝癌細胞運動中的調控作用，結果發現，與siCtrl組相比，siRRBP1組肝癌細胞的運動遷移距離變短(t=6.216，P=0.003)，表明下調RRBP1抑制了肝癌細胞的運動能力(圖4)。

圖4 劃痕實驗分析下調RRBP1對肝癌HLF細胞運動能力的影響

與劃痕實驗結果一致，Transwell遷移實驗同樣發現，與siCtrl組相比，siRRBP1組的肝癌細胞由小室上側遷移至小室下側的細胞數目變少(t=8.674，P<0.001)，進一步表明下調RRBP1抑制了肝癌細胞的運動遷移能力(圖5)。

圖5 Transwell遷移實驗分析下調RRBP1對肝癌HLF細胞遷移能力的影響

2.3 下調RRBP1表達對肝癌細胞侵襲能力的影響

利用Transwell侵襲實驗分析了下調RRBP1對肝癌細胞HLF侵襲能力的影響，結果發現，與siCtrl組相比，siRRBP1組肝癌細胞由基質膠一側侵襲至另一側的細胞數變少(t=4.426，P=0.012)，表明下調RRBP1同樣抑制了肝癌細胞的侵襲能力(圖6)。

圖6 下調RRBP1對肝癌細胞侵襲能力的影響

2.4 下調RRBP1表達對肝癌細胞上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影響

EMT是腫瘤細胞獲得遷移侵襲能力的重要機制，為分析RRBP1是否參與肝癌細胞的EMT，本研究用RT-PCR與蛋白質印跡技術實驗分析了干涉RRBP1對EMT標志分子表達的影響，結果發現，干涉RRBP1表達上調了上皮標志E-cadherin(t=9.733，P=0.001)與ZO -1(t=24.380，P<0.001)的mRNA與蛋白表達，下調了間質標志N-cadherin(t=14.643，P<0.001)與Vimentin(t=12.368，P<0.001)的mRNA與蛋白表達，表明下調RRBP1抑制了肝癌細胞由上皮向間質的轉化(圖7)。

圖7 干涉RRBP1對肝癌細胞EMT標志分子表達的影響

3 討論

內質網是細胞內調控物質運輸、生化反應與蛋白質合成等生物學過程的細胞器[1]。大量研究[7]表明，壓力環境導致的內質網應激及其介導的蛋白質非折疊反應在多種惡性腫瘤的發生發展過程中發揮了重要作用。RRBP1是位于內質網膜上參與內質網非蛋白折疊反應的重要蛋白之一，可能在促進腫瘤惡性進展中發揮作用，但目前RRBP1在肝癌中表達與生物學作用，尤其是其在促進腫瘤轉移中的作用尚不清楚。本研究利用生物信息學分析與免疫組化實驗發現，RRBP1在肝癌組織中表達高于正常肝組織。尤為重要的是，RRBP1表達在發生轉移的肝癌組織中高于未發生轉移的肝癌組織，表明RRBP1與肝癌轉移密切相關。與本研究所得結果類似，既往在膀胱癌中的研究[8-9]同樣發現，與正常膀胱組織相比，膀胱癌組織中RRBP1 表達上調。該研究還發現，RRBP1表達水平與膀胱癌患者是否發生淋巴轉移呈正相關。此外，宮頸癌[10]、前列腺癌[11]與食道癌[12]中的研究也均表明，RRBP1表達上調與淋巴結轉移呈正相關。

轉移是惡性腫瘤致死的最主要原因[13]，本研究中發現，RRBP1在肝癌轉移灶組織中表達高于原發灶，提示其可能在促進腫瘤轉移中發揮作用。因此，分別用劃痕實驗、Transwell遷移與侵襲實驗分析了RRBP1在肝癌運動、遷移與侵襲中的調控作用，結果發現，下調RRBP1抑制了肝癌的運動、遷移與侵襲，表明RRBP1表達上調促進了肝癌的轉移。在膀胱癌的研究[8]中發現，下調RRBP1可抑制膀胱癌細胞的遷移與侵襲。子宮內膜癌的研究[14]也證實，RRBP1高表達與腫瘤在肌層浸潤深度和淋巴結轉移中均呈正相關。在肝癌的研究[15]中發現，糖尿病患者的高血糖可促進肝癌細胞的增殖與轉移，而RRBP1表達上調是高血糖誘導肝癌生長與轉移的主要機制，進一步說明RRBP1在促進肝癌進展中發揮了重要作用。EMT是腫瘤細胞獲得遷移侵襲能力的重要機制[16-17]，但目前各種類型腫瘤中RRBP1表達上調是否參與EMT過程尚不清楚。在肝癌研究中[15]發現，干涉RRBP1后肝癌上皮標志分子E-cadherin與ZO-1表達上調，間質標志N-cadherin與Vimentin表達下調，表明下調RRBP1抑制了肝癌細胞由上皮樣向間質樣的轉化，提示RRBP1促進腫瘤細胞的遷移與侵襲可能是通過誘導細胞發生EMT。

綜上所述，RRBP1在轉移性肝癌組織中表達上調，并促進了細胞的遷移與侵襲，提示RRBP1是潛在抑制腫瘤轉移的分子靶標。