基于SLAF-seq技術鑒定蘋果砧木耐澇候選基因

宋春暉，陳曉菲，王枚閣，鄭先波，宋尚偉，焦健，王苗苗，馬鋒旺，白團輝?

1河南農業大學園藝學院，鄭州 450002；2西北農林科技大學園藝學院，楊凌 712100

0 引言

【研究意義】水分是決定植物生長的重要因子，但土壤水分過高則不利于植株生長，甚至導致澇害發生，澇害已成為影響作物生長發育，產量和品質的主要非生物脅迫之一[1-3]。蘋果（Malus×domestica Borkh）是我國主要栽培果樹樹種之一，其面積和產量均居世界首位。但在實際生產栽培中，由于夏、秋季的大量集中降雨和果園排水不良等因素，使部分蘋果樹常處于淹水狀態下，導致蘋果樹葉片黃化、脫落，樹體生長受抑制，果實產量和品質下降，嚴重時甚至植株死亡，造成嚴重的經濟損失，這已成為部分蘋果產區生產栽培中亟待解決的問題。因此，深入研究蘋果耐澇的遺傳機制，鑒定蘋果耐澇關鍵基因，對蘋果分子標記輔助育種和優質高產栽培具有重要意義。【前人研究進展】水分過多對植物的傷害并不在于水分本身，而在于淹水導致的根系缺氧[4]。植物在低氧逆境下，有氧呼吸受到抑制，呼吸電子傳遞受阻或中斷，內源激素代謝紊亂，細胞質酸化，乙醇、乳酸、活性氧等有害物質積累，造成生長受抑，嚴重時導致植物死亡[5-9]。隨著現代分子生物學的快速發展，在水稻、玉米、小麥和黃瓜耐澇遺傳機制研究方面取得了較大的突破和進展。XU等[10]通過基因定位的方法，找到2個與Sub1位點緊密連鎖的標記，證實了Sub1A-1是一個乙烯響應因子，并用轉基因的方法驗證了 Sub1A-1控制水稻的耐澇性。SEPTININGSIH等[11]利用含有敏感等位基因Sub1A-2的兩個中等耐淹親本，鑒定了3個新的耐淹 QTL。MANO 等[12]將玉米淹水脅迫后不定根形成的相關QTL分別定位到染色體3、4、7和8上。XU等[13]構建了黃瓜的遺傳連鎖圖譜，用圖位克隆技術分離到了一個黃瓜耐澇主效基因ARN6.1，該基因通過促進下胚軸不定根形成來適應澇害脅迫。【本研究切入點】簡化基因組測序（SLAF-seq）是一種基于高通量測序的目標性狀基因定位的技術，具有效率高、成本低、周期短等突出優勢，已被廣泛應用于作物遺傳圖譜構建和基因定位[14-16]。隨著蘋果全基因組測序的完成，利用 SLAF-seq鑒定蘋果砧木耐澇基因已可以實現。前期研究表明新疆野蘋果（M. sieverii Roem.）為不耐澇砧木[17-18]，G41為耐澇蘋果砧木[19]，也為耐澇基因的篩選提供了基礎。【擬解決的關鍵問題】本研究以G41和新疆野蘋果 F1雜交群體及其親本為材料，基于 SLAF-seq技術，利用雙親本與兩個極端混池，對蘋果耐澇性狀進行關聯分析，獲得目標基因的候選區域，對定位區間的基因進行功能注釋，挖掘蘋果耐澇的關鍵基因，旨在為蘋果耐澇相關基因的克隆和定向遺傳改良提供理論基礎。

1 材料與方法

試驗于 2015—2017年在河南農業大學和西北農林科技大學進行。

1.1 供試材料

本研究以耐澇砧木G41和不耐澇砧木新疆野蘋果（Malus sieversii（Ledeb.）Rome.）為親本及其構建的495株F1代群體為材料。

1.2 澇性性評價分析

將雜交種子層積處理，3月將層積好的種子播種到穴盤，當長到4片葉后，將其移栽入花盆（盆口直徑23 cm，盆底直徑20 cm，深度25 cm），正常管理。7月，雜交苗平均株高達到70 cm，將雜交苗進行淹水處理，花盆完全浸沒于水中，水面高于雜交苗根莖 3—5 cm。處理18 d后，統計幼苗的受害情況，然后進行恢復培養，恢復培養7 d后再次統計幼苗的受害情況。

澇害分級標準用10級記分制評定[16]。0級：正常；1級：頂尖葉片輕微黃化，1—3片黃化葉；2級：頂尖葉片中黃化，黃化葉片占整個植株葉片數10%以下；3級：頂尖黃化，黃化葉片占整個植株葉片數20%以下；4級：頂尖黃化，葉片下垂，黃化葉片占整個植株葉片數40%以下；5級：頂尖黃化，葉片下垂，黃化葉片占整個植株葉片數50%以下；6級：頂尖萎蔫，黃化葉片（15—20片黃葉）占整個植株的70%以下；7級：頂尖萎蔫，黃化葉片（25以上黃葉）占整個植株的80%以上；8級：葉片黃化干枯脫落，占整個植株的90%以下；9級：干枯死亡。

1.3 DNA提取、混池構建及測序

根據耐澇性評價分析結果，從495個株系中選出耐澇（0級）50株和不耐澇（9級）50株，每個株系分別提取基因組DNA，經純度和完整性檢測合格后，然后將各個混池中的基因組 DNA等量混合，構建兩個極端DNA混池，同時提取親本G41和新疆野蘋果的DNA，使用Rsa I和Hae Ⅲ限制性內切酶酶切基因組DNA，進行簡化基因組測序，測序由北京百邁客公司完成，具體步驟參照SUN等[20]的方法。

1.4 SLAF標簽和SNP標記的開發

將測序數據過濾掉低質量reads后，使用BWA軟件將過濾后的clean reads比對到蘋果‘金冠’參考基因組 GDDH13（https://iris.angers.inra.fr/gddh13/theapple-genome-downloads.html），使用 Picard tools（v1.102）軟件去除重復reads。使用GATK 3.6軟件進行局部比對、堿基質量值校正、SNP檢測與過濾，以確保檢測到的 SNP準確性。對初步鑒定到的 SNP進一步過濾，過濾掉有多個基因型的SNP位點，read支持度小于 4的 SNP位點，混池之間基因型一致的SNP位點以及隱性混池基因不是來自于隱性親本的SNP位點，最終得到高質量可信SNP。最后利用得到的 SLAF標簽和 SNP 標記位點對蘋果耐澇性狀進行關聯分析，獲得與性狀緊密關聯的位點。

1.5 候選基因的定位及分析

采用歐式距離法（euclidean distance，ED）計算每個位點ED值，根據ED值尋找混池間存在顯著差異的標記，并以此評估所獲得的分子標記與目標性狀緊密關聯的區域[21]。通過SNP-index關聯分析計算混池間的基因型頻率，獲得混池間存在顯著差異的基因型頻率，記為 ΔSNP-index[22]。將歐式距離法和SNP-index方法得到的關聯區域進行綜合分析。

1.6 ADH1表達分析

選擇耐澇和不耐澇的植株，進行淹水處理，于處理第0、0.5、1、2、4和6天采樣，使用改良CTAB法提取總 RNA，使用 PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司）對RNA進行反轉錄獲得cDNA。使用primer3軟件設計定量引物，ADH1定量引物為：F：5′-GGTCTC GCTGTACTTGTTGGT-3′和 R：5′-CGAATGGGACCG AATGAGTGAT-3′。定量儀器使用7500型實時熒光定量 PCR（Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR）。反應體系為 20 μL：10 μL ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），1 μL cDNA 模板，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，7 μL無菌蒸餾水。運行程序為：95℃預變性30 s；95℃變性3 s，60℃退火30 s，40個循環；95℃15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。Actin 作為內參，使用 2-??CT法計算基因相對表達量。

2 結果

2.1 耐澇性評價與分析

淹水脅迫后，從第3天開始，植株表現出不同程度的受害癥狀，主要表現為葉尖、葉緣變黃，葉片脫落，甚至死亡。雜交后代不同株系的耐澇性存在顯著差異，淹水18 d，有61個株系（12.3%）死亡，349個株系（70.6%）表現出不同程度的受害癥狀，然而84個株系（17.0%）未表現任何受害癥狀（圖1、2）。從圖2可以看出，G41×新疆野蘋果雜交后代F1分離群體耐澇性呈現連續性分布，表明蘋果耐澇性狀為數量性狀。淹水脅迫18 d后，進行恢復培養7 d，植株受害加重，90個株系（18.2%）死亡，158個株系（31.98%）受害嚴重，表現為葉片脫落，然而 62個株系（12.6%）未表現任何受害癥狀。

2.2 SLAF-seq測序質量分析

根據耐澇性評價分析結果，選擇50株耐澇和50株不耐澇株系，分別組成耐澇混池和不耐澇混池，分別提取基因組DNA，然后將各個混池中每個個體的基因組DNA等量混合，使用Rsa I和Hae Ⅲ限制性內切酶酶切基因組 DNA后，進行簡化基因組測序，同時對親本G41和新疆野蘋果進行基因組重測序。測序結果顯示，G41和新疆野蘋果總reads數分別為38 365 575和39 983 972，reads Q30所占比例分別為85.02%和87.82%。耐澇混池和不耐澇混池總reads數分別為10 873 511和10 279 180，reads Q30所占比例分別為89.47%和88.94%（表1）。以上數據表明測序數據充足，質量合格，可用于下一步分析。通過BWA軟件將各個樣本的 reads比對到參考基因組上，親本G41和新疆野蘋果總比對率分別為 97.55%和 97.48%，基因組平均覆蓋度為12X。耐澇混池和不耐澇混池reads總比對率分別為94.94%和93.01%，平均覆蓋度為3X。染色體覆蓋深度統計結果顯示基因組被覆蓋得較均勻，說明測序隨機性較好。

表1 樣品測序質量及與參考基因組的匹配情況Table 1 Quality of sample sequencing and matching of the data with reference genome

2.3 SLAF標簽和SNP標記的開發

將經RsaI和HaeⅢ限制性內切酶酶切基因組DNA，片段長度在364—414 bp的序列定義為SLAF標簽。經同一位點reads序列的相似性聚類和序列分析，共開發出 119 072個 SLAF標簽，每個染色體SLAF標簽變化范圍為3 011—6 297個（表2），平均測序深度為50.44X，達到了SLAF標簽預期。根據等位基因和基因序列之間的差異分析，從 SLAF標簽中共鑒定到多態性 SLAF有 11 133個。通過BWA軟件將SLAF標簽和多態性SLAF標記比對到參考基因組上，如圖 4所示，SLAF標簽和多態性SLAF標記比較均勻地分布在蘋果17條染色體上（圖3-A、B）。

表2 SLAF標簽和多態性SLAF標簽在染色體分布Table 2 Number of SLAF and polymorphism SLAF on each chromosome

使用GATK檢測SNP位點，親本間和混池間分別獲得5 093 595和1 143 476個SNP（表3）。對初步鑒定到的SNP進一步過濾，過濾掉有多個基因型的SNP位點（21 715個），reads支持度小于4的SNP位點（5 950 658）、混池之間基因型一致的SNP位點（0個）以及隱性混池基因不是來自于隱性親本的SNP位點（94 081），最終得到170 617個高質量SNP，用于后續關聯分析。

表3 樣品SNP信息統計Table 3 SNP information statistics of samples

通過歐氏距離（ED）算法，利用11 133個多態性SLAF進行蘋果砧木耐澇性狀的關聯分析，計算出關聯閾值為0.063。ED關聯值在染色體上的分布如圖4-A，根據關聯閾值判定，共得到2個區域，總長度為1.32 Mb，共包含124個基因，其中非同義突變SNP位點的基因共73個（表4）。

利用SNP-index方法計算關聯值，以‘金冠’蘋果為參考基因組，用170 617個SNP位點進行蘋果砧木耐澇性狀的關聯分析。分析每個SNP位點在每個池中的SNP-index（即SNP的頻率）。為了消除假陽性位點，利用標記在基因組上的位置，對同一條染色體上標記的 ΔSNP-index值進行擬合，并進一步采用DISTANCE法對ΔSNP-index進行擬合。利用擬合后ΔSNP-index的99百分位數，即0.375，共得到2個區域，總長度為6.97 Mb，共包含490個基因，其中非同義突變的基因共311個（圖4-B、表4）。

將采用歐式距離法和 SNP-index方法得到的關聯區域進行綜合分析，取其交集，將控制蘋果砧木耐澇性狀的基因定位在第 10號染色體 1.94—3.25 Mb，關聯區域大小為1.31 Mb，關聯區域內包含120個基因，編碼區存在非同義突變的基因66個（表4、表5）。

表4 蘋果砧木耐澇性狀的關聯分析Table 4 Correlation analysis of waterlogging tolerance traits of apple rootstocks

表5 定位區間基因功能預測Table 5 Functional annotation of gene mapping segments

續表5 Continued table 5

續表5 Continued table 5

2.4 候選區域基因功能注釋

根據關聯定位區間，提取‘金冠’參考基因組（GDDH13）第10號染色體1.94—3.25 Mb基因組信息。結果顯示，關聯區域內共包含120個基因（表5），其中6個為非編碼RNA（ncRNA），10個基因功能未知，其余為編碼蛋白質的基因。在114個編碼蛋白質的基因中有 5個轉錄因子，分別為 Dof（MD10G1017800）、bZIP（MD10G1023800）、Trihelix（MD10G1024800、MD10G1025100、MD10G1025200）。5個轉運蛋白，分別為液泡鐵轉運蛋白 VIT（MD10G1024000）、生長素輸出載體 PIN（MD10G1014300）、甘露醇運輸蛋白 VRG4（MD10G1016400）、銅轉運蛋白 SLC31A1（MD10G1019100）、線粒體S-腺苷甲硫胺酸運輸蛋白 SLC25A26（MD10G1020700），還有碳代謝相關基因果糖-1,6磷酸酶（MD10G1024400），乙醇脫氫酶ADH1（MD10G1014500），脂質代謝途徑酰基-酰基載體蛋白質去飽和酶FAB2（MD10G1014800）、17-雌二醇 17-脫氫酶/長鏈 3-氧酰基輔酶 a還原酶HSD17B12（MD10G1021200）等。

2.5 ADH1表達分析

進一步對候選基因乙醇脫氫酶基因ADH1進行定量表達分析，結果顯示（圖 5），在不耐澇植株中，ADH1在淹水處理0.5 d時顯著高表達，之后迅速降低。而在耐澇植株中，ADH1表達波動較小。ADH1在淹水處理0.5 d時，在不耐澇植株中的表達量顯著高于耐澇植株，而在淹水處理第1、2、4和6 d，ADH1在耐澇植株中的表達量顯著高于不耐澇植株。

3 討論

隨著全球變暖，極端氣候頻繁出現，降雨量分布不均衡，經常發生大面積不同程度的澇害，對農作物、蔬菜和果樹等的產量和品質造成了嚴重影響[3,6,8]。目前，針對獼猴桃[23]、桃[5,24]、葡萄[25-26]和蘋果[9,17,19,27]等果樹開展了耐澇研究，但大多數集中在表型鑒定和生理生化水平。SLAF-seq技術具有低成本且高通量開發 SNP標記及基因分型的優勢，國內外研究者利用此技術在多種作物上獲得了與目標性狀顯著相關的分子標記及候選基因[13-16]。SONG等[28]用SLAF-seq技術定位了水稻耐冷性狀的QTL。DONG等[14]利用 SLAF-Seq技術將大豆矮化基因定位到了第19條染色體上，關聯區域為80.72 kb，并預測了 3個與大豆矮化的相關基因。賈秀蘋等[29]通過此技術挖掘到了6個向日葵耐鹽候選基因。因此，SLAF-Seq技術能廣泛應用于基因定位，對相關性狀候選基因的預測，可為基因的精細定位和克隆奠定基礎。本研究采用SLAF-seq技術共開發了多態性SLAF有11 133個，通過序列分析和檢測SNP位點，共獲得了高質量SNP有170 617個。最終獲得一個與耐澇性狀緊密關聯的候選區域，位于蘋果第10號染色體1.94—3.25 Mb。

水澇脅迫對植物的傷害程度因物種而異，即使同一物種不同基因型間也存在顯著差異，因此，闡明植物對水澇脅迫響應的差異機理和耐澇遺傳機制是研究其對植物傷害的前提和基礎。深水稻采取避淹策略，通過節間伸長生長使植株頂端浮出水面與空氣保持接觸，以避免完全淹沒[30]。淺水稻采取耐淹策略，在淹水期間表現為緩慢生長、維持存活，避免與莖稈伸長等能量消耗，當水退去后，再利用保存的能量恢復生長[10,31]。黃瓜在淹水情況下，會在根莖處形成不定根，通過不定根從空氣中獲取氧氣[13]。蘋果耐澇的表型明顯不同于深水稻的“避淹策略”。本研究使用一年生實生苗為材料，試驗中出現不定根的情況比較少見，但在澇害嚴重的成年蘋果園中，一些蘋果樹會在地面附近形成粗短的氣生根，來適應澇害。因此，推測蘋果可能通過不同的策略抵抗澇害，一種是形成氣生根；另一種是在淹沒期間表現為緩慢生長且維持存活，以避免能量消耗。前期研究表明淹水造成低氧逆境對呼吸代謝系統及相關基因表達都產生了顯著影響[32]。但這些基因是如何應答淹水脅迫、作用大小及其相互關聯方式，目前尚不十分清楚。

本研究在蘋果耐澇性狀關聯區域，共注釋到120個基因，其中有 5個轉錄因子。在這些基因中，推測ADH1是一個潛在的重要基因。本研究結果顯示隨著淹水處理的延長，ADH1在耐澇植株中的表達量顯著高于不耐澇植株。淹水脅迫會提高乙醇脫氫酶ADH1活性，為細胞維持必要的生命活動提供能量[32]。植物在淹水條件下，降低的氧氣水平通過干擾電子傳遞鏈，抑制 ATP的產生，限制了線粒體的呼吸作用，進而導致植物對能量的需求增加。當淹水脅迫造成能量短缺時，植物通過糖酵解和乙醇發酵途徑獲得必需的能量[33]。丙酮酸可通過乳酸脫氫酶 LDH轉化為乳酸，或丙酮酸可通過丙酮酸脫羧酶PDC脫羧形成乙醛，再通過乙醇脫氫酶ADH還原為乙醇[6,34]。控制淺水稻耐淹性狀的主效基因SUB1A可以增強乙醇脫氫酶ADH1的表達[31]。在淹水脅迫下，GmADH2轉基因大豆種子萌發能力得到增強[34]。因此，推測乙醇脫氫酶基因 ADH1可能在蘋果砧木耐澇中起重要作用，下一步將對該基因進行功能驗證。

4 結論

本研究利用耐澇蘋果砧木G41和不耐澇蘋果砧木新疆野蘋果及其構建 F1雜交群體為材料，基于SLAF-seq技術，共開發了119 072個SLAF標簽，其中多態性SLAF有11 133個，共獲得6 237 071個SNP，其中高質量SNP有170 617個。通過ED和SNP-index方法關聯分析，獲得1個與耐澇性狀緊密關聯的候選區域，位于蘋果第10號染色體1.94—3.25 Mb，關聯區域大小為1.31 Mb，關聯區域內包含120個基因，對該區域內基因進行功能注釋，發現1個與呼吸代謝相關的基因乙醇脫氫酶基因 ADH1，可能在蘋果砧木耐澇中起重要作用。